乙肝表面抗原的elisa法定量分析方法學(xué)驗(yàn)證-論文

1、<p><b>　　畢業(yè)論文</b></p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘要</b></p><p><b>　　關(guān)鍵詞</b></p><p><b>　　英文</b></p&g

2、t;<p><b>　　前 言</b></p><p><b>　　1. 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 試劑盒</b></p><p><b>　　1.2 儀器</b></p><p><b>　　1.

3、3 方法</b></p><p>　　1.3.2．鋪板方案</p><p>　　1.3.3．加樣步驟</p><p><b>　　2. 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍</p><p>　　2.2 準(zhǔn)確度（回收率）的驗(yàn)證</p><p&

4、gt;　　2.3 精密度的驗(yàn)證</p><p>　　2.3.1 板內(nèi)精密度的驗(yàn)證</p><p>　　2.3.2 板間精密度的驗(yàn)證</p><p>　　2.4 檢測限（LOD）計(jì)算</p><p><b>　　3. 討論</b></p><p>　　3.1 乙肝表面抗原定量分析的意義</p&

5、gt;<p>　　3.2 常用定量分析方法</p><p><b>　　3.3 方法概述</b></p><p>　　3.4 方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容</p><p>　　3.5 結(jié)果分析及應(yīng)用評價(jià)</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p><b

6、>　　致謝</b></p><p><b>　　附錄</b></p><p>　　乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗(yàn)證</p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　目的：對福州藍(lán)圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)

7、證，以判斷是否能用于臨床樣本分析。方法：ELISA法定量分析，應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8ng/ml做2倍稀釋的6個(gè)濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個(gè)濃度梯度5復(fù)孔做準(zhǔn)確度，精密度和檢測限等方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.997，準(zhǔn)確度97.07%，1.5ng/ml的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求，檢測限LOD為0.172ng/ml，</p>&

8、lt;p>　　低濃度樣品（<1.5ng/ml）的檢測在準(zhǔn)確性和精密度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測。結(jié)論：該HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒不能用于臨床標(biāo)本的分析。</p><p><b>　　關(guān)鍵詞</b></p><p>　　乙肝表面抗原 ELISA 定量分析 方法學(xué)驗(yàn)證</p><p>　　The

9、reification of the HBsAg ELISA quantitative methodology</p><p><b>　　Abstract</b></p><p>　　Object: to verify the quantitative methodology of Fuzhou blueprint biological engineering co

10、mpany to make sure whether it ca be used to the analysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative methodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted si

11、x concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately precise and detection .Results: standard curve ,R2=0.997, the </p><p><b>　　

12、Key words</b></p><p>　　HBsAg Quantitative analysis Verification Methodology.</p><p><b>　　前 言</b></p><p>　　乙肝病毒感染是我國最常見的感染性疾病之一，而乙型肝炎血清標(biāo)志物是檢測乙肝病毒感染最主要的病原標(biāo)志。隨著

13、免疫學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，抗原抗體檢測靈敏度明顯提高，使低水平乙肝病毒得以檢出，對臨床診斷及流行病學(xué)有重要意義[1]。ELISA法具有較高靈敏度、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、可進(jìn)行定量和半定量測定等優(yōu)點(diǎn)，可以在酶免疫分析儀上做批量檢測。目前臨床上多傾向于做定量分析，若想知道檢驗(yàn)結(jié)果是否可靠，實(shí)驗(yàn)室則必須對所用試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)對福州藍(lán)圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確度，精密度和檢測限等方法學(xué)驗(yàn)證，現(xiàn)報(bào)

14、告如下。</p><p><b>　　材料與方法</b></p><p>　　1.1 試劑盒 乙肝表面抗原ELISA法定量分析試劑盒，福州藍(lán)圖生物工程有限公司出品。</p><p><b>　　1.2 儀器</b></p><p>　　酶標(biāo)儀：Bio-Rad 680 ；洗板機(jī)：Bio-Rad 15

15、75；超純水系統(tǒng)：Millipore Elix ；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；振蕩器（蘇州管械，KJ-201A）；移液器；Tip頭；EP管。</p><p><b>　　1.3 方法</b></p><p>　　1.3.1．溶液配置</p><p>　　1×PBS緩沖液的配置： 稱取8g NaCl、

16、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，溶于800ml蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。</p><p>　　標(biāo)準(zhǔn)品的配置：原始標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8 ng/ml。。取6個(gè)2mlEP管，分別標(biāo)記為S1-S6。50ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul備用，按照下表稀釋方案進(jìn)行稀釋。</p><p>　　質(zhì)控品的配置

17、：50ul/well, 共5復(fù)孔需250ul，配置300ul備用，取3個(gè)2mlEP管，分別標(biāo)記為C1，C2，C3，按照下表稀釋方案進(jìn)行稀釋。</p><p>　　1.3.2．鋪板方案 取出試劑盒中已包被酶標(biāo)板，取出板條，按照下表鋪板方案進(jìn)行鋪板在相應(yīng)孔中依次加入系列標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品及空白對照，每孔50ul?？瞻讓φ占尤?×PBS緩沖液。</p><p>　　1.3.3．加樣步驟&l

18、t;/p><p>　　加入酶標(biāo)抗體，50 ul/well，震蕩。37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min，取出后洗板4次， 加入A、B液, 50 ul/ well，37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育15 min。加入終止液，50 ul/ well。酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，蓋上蓋子，在電腦上打開Microplate Manager 5.2軟件，選擇450nm波長（參照波長630nm），設(shè)置LAYOUT和報(bào)告模式，測定各孔吸收值。</p

19、><p><b>　　結(jié)果</b></p><p>　　2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍</p><p>　　標(biāo)準(zhǔn)品理論濃度對應(yīng)的實(shí)測OD值</p><p>　　以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo)，所測OD值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系，結(jié)果顯示R2=0.9973，顯示具有良好的相關(guān)性</p><p>

20、　　2.2 準(zhǔn)確度（回收率）的驗(yàn)證 </p><p>　　質(zhì)控品理論稀釋濃度對應(yīng)實(shí)測濃度值</p><p>　　質(zhì)控品做了3個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度做了5個(gè)復(fù)孔，下表是對每個(gè)濃度梯度進(jìn)行準(zhǔn)確度（回收率）的驗(yàn)證。</p><p>　　結(jié)果顯示HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的平均回收率為97.58%，113.07%，滿足限度要求在85%-115%的范圍內(nèi)，而HBsA

21、g 1.5ng/ml的平均回收率為80.56%，滿足方法定量限在80%-120%的范圍內(nèi)。3個(gè)濃度梯度的平均回收率為97.7%，顯示準(zhǔn)確性好。</p><p><b>　　2.3精密度的驗(yàn)證</b></p><p>　　2.3.1 板內(nèi)精密度的驗(yàn)證</p><p>　　上表中RSD(%)這一參數(shù)表示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，也就是變異系數(shù)CV值，HBsAg

22、 6ng/ml的5個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精密度不高，但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其它孔比較差異較大，可能是由于操作引起例如加樣不準(zhǔn)。而3ng/ml,和1.5ng/ml的變異系數(shù)CV為3.5%，3.7%，符合顯示孔間重復(fù)性好，符合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)<15%的要求，精密度高。</p><p>　　2.3.

23、2 板間精密度的驗(yàn)證</p><p>　　從同一實(shí)驗(yàn)室中獲取2組同樣的數(shù)據(jù)，做板間精密度的驗(yàn)證。首先對同一實(shí)驗(yàn)條件下不同實(shí)驗(yàn)人員所獲得的數(shù)據(jù)是否可用于板間分析做驗(yàn)證。</p><p>　　以HBsAg理論濃度為橫坐標(biāo)，所測OD值為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線觀察線性關(guān)系。</p><p>　　以上標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2 =0.967，第三組數(shù)據(jù)R2 =0.9

24、91。第二組數(shù)據(jù)由于有一些孔與標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離較大，但考慮到隨機(jī)抽樣與均數(shù)存在一定誤差，還是可以用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。下表對3組數(shù)據(jù)做板間分析。</p><p>　　從表中3個(gè)組的數(shù)據(jù)比較可知，HBsAg 6ng/ml和3ng/ml的RSD分別為9.10%，12.06%，滿足對ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求，精密度高。而HBsAg 1.5ng/ml的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一

25、般應(yīng)<15%的要求，顯示低濃度的孔間重復(fù)性差，精密度不是很高，故以下對HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的三組數(shù)據(jù)做分析。</p><p>　　對HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的準(zhǔn)確性，精密度分析</p><p>　　從上表可知第一組數(shù)據(jù)和第三組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性差，精密度高。而第二組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高，而精密度相對于第一組和第三組數(shù)據(jù)要好。綜上對于HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的這

26、一低濃度梯度的板內(nèi)準(zhǔn)確性和板間精密度相對于高濃度的線性要差一些。</p><p>　　2.4 檢測限（LOD）計(jì)算</p><p>　　LOD為取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標(biāo)準(zhǔn)差。</p><p>　　由上表可知，LOD為0.172。檢測限（LOD）表示分析方法檢測低濃度樣品的能力，也稱為方法的靈敏度，LOD通常為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)，要求標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度點(diǎn)應(yīng)

27、>LOD，此標(biāo)準(zhǔn)曲線上最低濃度點(diǎn)為0.25，大于LOD（0.172），故此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性好。</p><p><b>　　3. 討論</b></p><p>　　3.1 乙肝表面抗原定量分析的意義</p><p>　　乙肝表面抗原是乙肝兩對半的其中一項(xiàng)，乙肝兩對半定性檢測對乙肝疾病的診斷，病情監(jiān)測，療效觀察起到了一定的作用。但隨著臨床醫(yī)學(xué)的

28、發(fā)展，乙肝兩對半定性檢測已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床及患者的要求，特別是在療效觀察以及乙肝疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上有明顯的不足。隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乙肝兩對半定量測定成為可行，大大彌補(bǔ)了乙肝兩對半定性檢測的不足。而且乙肝兩對半定量檢測可與HBV DNA熒光測定相互補(bǔ)充，綜合評價(jià)患者病情與藥物療效，為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者提供了正確判斷病情的依據(jù)【2】。這在目前的臨床治療中應(yīng)用十分廣泛。</p><p>　　

29、3.2 常用定量分析方法</p><p>　　此次實(shí)驗(yàn)只是對一種試劑盒的可用性進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證， 而目前常用的定量方法已有很多，如TRFIA，TRFIA法又稱解離增強(qiáng)鑭系熒光免疫分析，是近十年發(fā)展起來的一種微量分析方法。此技術(shù)集酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)于一身，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，且測定范圍更寬，試劑盒貨架壽命長，操作簡便和非放射性等特點(diǎn)，成為最有潛力的一種標(biāo)記免疫分析方法【3】。全自動酶免分析儀

30、目前也廣泛應(yīng)有，自動化、標(biāo)準(zhǔn)化的操作手段使實(shí)驗(yàn)達(dá)到了全過程控制和全過程標(biāo)準(zhǔn)化分析，大大提高了實(shí)驗(yàn)的精密度【4】，使檢測結(jié)果更趨穩(wěn)定，從而保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。</p><p><b>　　3.3 方法概述</b></p><p>　　目前普遍使用的HBsAg試劑盡管在制備時(shí)采用了高親和力的單克隆抗體，并且使包被抗體、酶標(biāo)抗體的結(jié)合位點(diǎn)盡可能的遠(yuǎn)。以避免競爭抑制，最大

31、程度地解決鉤狀效應(yīng)（HOOK）的問題【5】。本次實(shí)驗(yàn)是對實(shí)驗(yàn)室的一種試劑盒，即福州藍(lán)圖生物工程有限公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以判斷是否能用于臨床樣本分析。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。往預(yù)先包被HBsAg捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本，標(biāo)準(zhǔn)品，HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物的催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色。顏色的深淺和樣

32、品中得HBsaAg呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度OD值，計(jì)算樣品濃度。</p><p>　　應(yīng)用試劑盒HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品從濃度為8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6個(gè)濃度梯度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個(gè)濃度梯度5復(fù)孔做質(zhì)控，進(jìn)行準(zhǔn)確度，精密度和檢測限等方法學(xué)驗(yàn)證。選擇最低濃度為0.25ng/ml的原因是因?yàn)椋^大多數(shù)HBV感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量在5ng/m

33、l ～600ug/ml之間，高者可達(dá)2000ug／ml以上【6】，滿足了現(xiàn)階段文獻(xiàn)報(bào)道的最低濃度值。</p><p>　　3.4 方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容</p><p>　　方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容一般包括標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確度，精密度和檢測限。標(biāo)準(zhǔn)曲線亦稱校正曲線，系指生物樣品中所測定的樣品濃度與響應(yīng)的相關(guān)性，通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評件，此實(shí)驗(yàn)所用了6個(gè)濃度點(diǎn)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法準(zhǔn)確度指待測濃度與真實(shí)

34、濃度的接近值了，一般用相對回收率表示，限度要求在85%—115%的范圍內(nèi)。精密度則表示分析方法的可重復(fù)性，是對同一樣品每次測定結(jié)果的一致性，用標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，可做板內(nèi)和板間的驗(yàn)證，對于ug/ml級水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng)<10%, ng/ml級水平的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差一般應(yīng)<15%。檢測限則表示分析低濃度樣品的能力，通常又稱為靈敏度。</p><p>　　3.5 結(jié)果分析及應(yīng)用評價(jià)</p&

35、gt;<p>　　第一組數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.9973，顯示具有良好的相關(guān)性，HBsAg 濃度為6ng/ml和3ng/ml 的回收率分別為為97.58%，符合113.07%，符合限度要求在85%—115%的范圍內(nèi)。但是HBsAg 濃度為.5ng/ml的回收率為80.56%，顯示此試劑盒對于低濃度樣品的檢測準(zhǔn)確度差。在精密度方面，6，3，1.5ng/ml變異系數(shù)CV分別為12.73% ，3.69% ，3.50%，而HBsAg

36、 6ng/ml的5個(gè)復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%，顯示孔間差異較大，精密度不高，但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)<15%的要求，其中有一孔濃度為4.55，與其它孔比較差異較大，可能是由于操作引起例如加樣不準(zhǔn)不屬于試劑盒的問題，故可以認(rèn)為此試劑盒對于批內(nèi)高、低濃度樣品的檢測精密度還是可以的。在做3個(gè)組數(shù)據(jù)的批間的精密度分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)6，3，1.5ng/ml變異系數(shù)CV分別9.10%，12.06%，16.78%，分布方式從

37、低到高，前2個(gè)濃度滿足對ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要求。1.5ng/ml的RSD為16.78%，不滿足ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)<15%的要</p><p>　　綜上分析，該試劑盒對于高濃度樣品的檢測具有良好的準(zhǔn)確性和較高的精密度，而對于低濃度樣品（<1.5ng/ml）的檢測在準(zhǔn)確性和精密度方面都低于高濃度樣品，不適合低濃度樣品的檢測。目前絕大多數(shù)HBV感染者外周血HBsAg濃

38、度很低，該試劑盒不能全面檢測出此類人群，故該試劑盒不能用于臨床標(biāo)本的檢測。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　【1】魏來，陶其敏．努力規(guī)范肝臟疾病的免疫學(xué)診斷．中華檢驗(yàn)雜志，2003，26：69—71</p><p>　　【2】劉曉梅，張世蘭．HBsAg陰性結(jié)果的慢性乙型肝炎患者病毒血癥水平與臨床的關(guān)系[J】．臨

39、床檢驗(yàn)雜志，2004，22(5)：381-382．</p><p>　　【3】李輝霞，王德志，楊朋，乙肝兩對半定量檢測及臨床意義，醫(yī)學(xué)信息雜志2010，23（9）。</p><p>　　【4】 Weber B, Dengler T, Berger A .Evaluation of two new autom ated assays for hepatitis B virus surfac

40、e HBsAg detection IMMUIITE HBsAg_and IMMUlITE 2000 HBsAg[ J] ．J .Clin Microbiol,2003 ,41,(1 )；13 5—143 ．</p><p>　　【5】鄭懷競．臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)量保證[M]．北京：北京醫(yī)科大</p><p>　　學(xué)，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1995，99．</p>&l

41、t;p>　　【6】王朝陽，段文強(qiáng) ,乙肝兩對半陰陽性之臨床意義，中國社區(qū)醫(yī)師雜志，2007，26(1)：12-13. </p><p><b>　　致 謝</b></p><p>　　在論文完成之際，我首先向關(guān)心幫助和指導(dǎo)我的指導(dǎo)老師表示衷心的感謝并致以崇高的敬意！</p><p>　　在學(xué)校的學(xué)習(xí)生活即將結(jié)束，面對現(xiàn)在的收獲，我感到無

42、限欣慰。為此，我向熱心幫助過我的所有老師和同學(xué)表示由衷的感謝!在論文工作中，遇到了許許多多這樣那樣的問題，有的是專業(yè)上的問題，有的是論文格式上的問題，一直得到老師的親切關(guān)懷和悉心指導(dǎo)，使我的論文可以又快又好的完成，老師以其淵博的學(xué)識、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度、求實(shí)的工作作風(fēng)和他敏捷的思維給我留下了深刻的印象，我將終生難忘我的老師對我的親切關(guān)懷和悉心指導(dǎo)，再一次向他表示衷心的感謝，感謝他為學(xué)生營造的濃郁學(xué)術(shù)氛圍，以及學(xué)習(xí)、生活上的無私幫助! 值此論

43、文完成之際，謹(jǐn)向老師致以最崇高的謝意!</p><p>　　最后，衷心地感謝在百忙之中評閱論文和參加答辯的各位專家、教授!</p><p><b>　　附 錄</b></p><p>　　乙肝表面抗原是乙肝兩對半的其中一項(xiàng)，乙肝兩對半定性檢測對乙肝疾病的診斷，病情監(jiān)測，療效觀察起到了一定的作用。但隨著臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展，乙肝兩對半定性檢測已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)