HBV和HCV時間分辨熒光免疫分析試劑盒的研制.pdf

1、標(biāo)記免疫分析技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床各個領(lǐng)域。近年來，由于新原理、新技術(shù)的不斷應(yīng)用，標(biāo)記免疫技術(shù)得到了長足的發(fā)展。最常用的標(biāo)記免疫分析技術(shù)是放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）和酶免疫分析（Enzymatic immunoassay，EIA），但RIA和EIA在應(yīng)用中也存在著一些缺陷：RIA的放射性核素污染、標(biāo)記物的貨價期短；EIA酶的活性容易失活，導(dǎo)致EIA的靈敏度不高，酶的大

2、分子標(biāo)記容易影響被標(biāo)記物的空間結(jié)構(gòu)，使得EIA靈敏度的提高受到限制。而用普通熒光分子作為標(biāo)記物容易受到散射光、樣品的背景熒光和熒光淬滅等諸多因素的干擾，導(dǎo)致分析的靈敏度低，很難適應(yīng)微量抗原抗體檢測的需要。20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的時間分辨熒光免疫分析（Time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）技術(shù)，克服了放射免疫分析的同位素污染、半衰期短及酶免疫分析方法穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，具有快速、靈敏、穩(wěn)定等特點(diǎn)，并廣

3、泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。 丙型肝炎病毒抗體（anti-HCV）是機(jī)體感染丙肝病毒后產(chǎn)生的針對丙肝病毒的抗體，不具有保護(hù)性，目前在醫(yī)院和血液系統(tǒng)廣泛使用的檢測方法為酶免疫分析法，但酶免法靈敏度較低，易造成漏檢；乙型肝炎病毒核心抗體IgM（抗HBc-IgM）是機(jī)體對HBV的感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，IgM抗體陽性常表示病毒的近期感染，是HBV感染者血清中最早出現(xiàn)的特異性抗體，是HBV復(fù)制具有傳染性的標(biāo)志，目前相關(guān)的檢測方法有微

4、粒子酶免疫分析（MEIA）法、酶聯(lián)免疫法和固相放射免疫法（SPRIA），酶免法較其他兩種方法更具臨床可操作性，且不會有放射性同位素的污染，但是酶免法本身也存在靈敏度不夠高、酶標(biāo)記物不穩(wěn)定的缺點(diǎn)；乙型肝炎病毒前S1抗原（HBV-preS1Ag）是乙肝病毒基因組S基因區(qū)中preS1基因編碼的產(chǎn)物，在急性乙型肝炎中，疾病早期轉(zhuǎn)氨酶升高前即可檢測出前S1抗原，也可作為乙肝病毒感染的早期診斷指標(biāo)。若preS1先于HBV-DNA陰轉(zhuǎn)是病毒清除的最早

5、跡象，提示疾病的預(yù)后良好，反之preS1抗原持續(xù)陽性，將發(fā)展至慢性肝炎。檢測抗HBc-IgM和HBV-preS1Ag是對診斷急性乙型肝炎的補(bǔ)充和加強(qiáng)，因此他們已成為臨床上除了乙肝五項(xiàng)之外的常規(guī)檢查項(xiàng)目。 本研究主要是運(yùn)用時間分辨熒光免疫分析技術(shù)依次采用間接法、捕獲法和雙抗體夾心法研制丙型肝炎病毒抗體、乙肝病毒核心抗體IgM和乙肝病毒前S1抗原的診斷試劑，評價試劑的各項(xiàng)性能指標(biāo)包括：準(zhǔn)確性及靈敏度、cutoff值的確定、特異性、精

6、密度、穩(wěn)定性，并與國內(nèi)同類的ELISA診斷試劑進(jìn)行比較，評價其應(yīng)用于臨床檢測的可行性。研究結(jié)果顯示（1）抗-HCV-TRFIA試劑盒的準(zhǔn)確性及靈敏度均符合抗HCV試劑國家標(biāo)準(zhǔn)品所規(guī)定的要求；cutoff值為陰性對照熒光值×2.1；與抗HBs、抗HBe、抗HBc、梅毒螺旋體抗體、HIV（1+2）抗體國家標(biāo)準(zhǔn)品中的精密度參考品無交叉反應(yīng)，特異性較好；試劑盒分析內(nèi)變異系數(shù)為3.2%-9.3%，分析間變異系數(shù)為4.6%-8.9%；試劑放置于37

7、℃7天或者4℃一年，檢測熒光值無明顯下降且分析內(nèi)CV<10%，分析間CV<15%，穩(wěn)定性較好；檢測樣本不受甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白的干擾；測定508份臨床血清標(biāo)本與國內(nèi)同類試劑比較，自制試劑優(yōu)于酶免試劑且靈敏度更高。（2）抗HBc-IgM TRFIA試劑盒的cutoff值為陰性對照熒光值×2.5；與抗-HBs，抗-HBc-IgG，抗-HBe抗體無交叉反應(yīng)；分析內(nèi)及分析間變異系數(shù)均小于10%；試劑可在4℃穩(wěn)定一年，37℃穩(wěn)定7天，分析內(nèi)

8、及分析間CV仍低于10%；檢測樣本不受甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白的干擾；測定584份臨床血清標(biāo)本與國內(nèi)同類試劑比較，自制試劑優(yōu)于酶免試劑且特異性更高。（3）HBV-preS1Ag TRFIA試劑盒的cutoff值為陰性對照熒光值×2.5；與用正常人血清稀釋的HBsAg和HBeAg無交叉反應(yīng)；試劑盒分析內(nèi)變異系數(shù)為3.2%～8.3%，分析間變異系數(shù)為5.1%～10.9%；試劑放置于37℃7天或者4℃一年，分析內(nèi)CV<10%，分析間CV<1