黃色短桿菌載體系統(tǒng)的構(gòu)建及其產(chǎn)L-纈氨酸代謝工程育種的初步研究.pdf

1、自人們首次分離到生產(chǎn)L-谷氨酸的谷氨酸棒狀桿菌以來(lái),非致病性土壤棒桿菌的三個(gè)主要代表種:谷氨酸棒狀桿菌、黃色短桿菌和乳糖發(fā)酵短桿菌,已經(jīng)被廣泛用于氨基酸的工業(yè)化生產(chǎn)。目前代謝工程育種已經(jīng)成為棒狀桿菌菌種改良的主要策略?？蓱?yīng)用于棒狀桿菌的載體系統(tǒng),是棒狀桿菌分子生物學(xué)研究以及代謝工程育種的基礎(chǔ)。由于自身存在缺點(diǎn),已有的棒狀桿菌載體在某些情況下不適合用于代謝工程研究。本研究主要進(jìn)行了新的黃色短桿菌載體系統(tǒng)的構(gòu)建工作,并進(jìn)行了黃色短桿菌產(chǎn)L-

2、纈氨酸代謝工程育種的初步研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 (1)構(gòu)建了一個(gè)新型E.coli-B.flavum穿梭型誘導(dǎo)表達(dá)載體pDXW-8。pDXW-8有如下特點(diǎn):pDXW-8具有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)oriE,棒狀桿菌雙鏈復(fù)制起點(diǎn)dso及單鏈復(fù)制起點(diǎn)sso;具有兩個(gè)抗生素抗性標(biāo)記-青霉素抗性基因amp和和那霉素抗性基因kan;使用tac啟動(dòng)子表達(dá)目的基因;使用lacPF104來(lái)控制tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄;具有一個(gè)長(zhǎng)的多克隆位點(diǎn)MCS。與已

3、經(jīng)存在的棒狀桿菌表達(dá)載體相比,pDXW-8最主要的優(yōu)點(diǎn)有兩個(gè):一是它的MCS包含多達(dá)11個(gè)單限制性內(nèi)切酶切點(diǎn),這保證了載體可以非常方便地用于克隆攜帶許多限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的DNA片段以及同一代謝途徑中的多個(gè)基因;另一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是lacPF104基因可以嚴(yán)格控制tac啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄,確保了有毒基因在棒狀桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)。在大腸桿菌、黃色短桿菌和谷氨酸棒桿菌中使用載體pDXW-8表達(dá)vhb基因的實(shí)驗(yàn)證明:pDXW-8是一個(gè)適用于棒狀桿菌代謝工程

4、研究的新型載體。
　　 (2)構(gòu)建了一個(gè)新的大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭型啟動(dòng)子探測(cè)載體pDXW-11。pDXW-11具有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)oriE,棒狀桿菌雙鏈復(fù)制起點(diǎn)dso及單鏈復(fù)制起點(diǎn)sso;使用卡那霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記。啟動(dòng)子探測(cè)相關(guān)區(qū)域有如下特性:rrnBT1T2終止子緊鄰多克隆位點(diǎn)MCS,位于其上游,這阻止了MCS上游潛在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄通讀;包含7個(gè)單切點(diǎn)序列的MCS位于報(bào)告基因cat的上游;MCS和cat之間具有三個(gè)串

5、聯(lián)的終止密碼子,這阻止了潛在的插入片段的翻譯通讀。在黃色短桿菌中應(yīng)用pDXW-11檢測(cè)了6個(gè)啟動(dòng)子,其活性從強(qiáng)到弱的依次為:tac-M,Pkan,tac-Ml,tac,PF104和PilvA。這些啟動(dòng)子,尤其是強(qiáng)啟動(dòng)子tac-M,對(duì)于棒狀桿菌代謝工程研究具有非常重要的意義。
　　 (3)構(gòu)建了一個(gè)新型E.coli-B.flavum穿梭組成型表達(dá)載體pDXW-10。pDXW-10有如下特點(diǎn):具有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)oriE,棒狀桿菌雙

6、鏈復(fù)制起點(diǎn)dso及單鏈復(fù)制起點(diǎn)sso;具有卡那霉素抗性基因kan;具有一個(gè)長(zhǎng)的多克隆位點(diǎn)MCS;使用tac-M啟動(dòng)子表達(dá)目的基因。與已有的棒狀桿菌表達(dá)載體相比,pDXW-10有如下優(yōu)點(diǎn):首先,長(zhǎng)的MCS非常方便用來(lái)克隆DNA大片斷;第二,在tac-M啟動(dòng)子的控制下,插入的目的基因進(jìn)行中度水平的表達(dá),而中度水平的酶量非常適合于細(xì)胞代謝產(chǎn)物的生產(chǎn);第三,是克隆在載體中的基因在棒狀桿菌中實(shí)施組成型表達(dá),這非常有益于工程菌株的大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生

7、產(chǎn)目的產(chǎn)物;第四,在E.coli中使用。pDXW-10表達(dá)目的基因時(shí)仍需要IPTG的誘導(dǎo),這將有助于克隆那些用于棒狀桿菌代謝工程改造而對(duì)E.Coli細(xì)胞有毒性的基因。在大腸桿菌和黃色短桿菌中應(yīng)用載體pDXW-10表達(dá)氯霉素?；D(zhuǎn)移酶CAT,結(jié)果CAT在大腸桿菌呈現(xiàn)高水平表達(dá),在黃色短桿菌呈現(xiàn)中度水平表達(dá)。pDXW-10是用于棒狀桿菌代謝工程研究的一個(gè)理想的表達(dá)載體。
　　 (4)初步構(gòu)建了可應(yīng)用于黃色短桿菌基因無(wú)痕敲除和替代的整

8、合型載體pDXW-3。通過(guò)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明已有的用于棒桿菌基因敲除及替代的整合型載體pK18mobsacB在黃色短桿菌B.flavum ATCC14067中轉(zhuǎn)化效率非常低,不能用于黃色短桿菌基因的無(wú)痕敲除和替代研究。pDXW-3能高效轉(zhuǎn)化B.flavum ATCC14067,以kan作為正向篩選標(biāo)記,使用lac-M啟動(dòng)子的sacB基因作為反向篩選標(biāo)記,可用于黃色短桿菌基因無(wú)痕敲除和替代。
　　 (5)初步構(gòu)建了一株過(guò)量積累L-纈氨酸

9、的黃色短桿菌工程菌株。從谷氨酸棒桿菌模式菌株C glutamicum ATCC13032中克隆出L-纈氨酸合成途徑上的限速酶-乙酰羥酸合酶編碼基因ilvBN。對(duì)ilvBN進(jìn)行定點(diǎn)突變,獲得其抗反饋抑制突變型ilvBNr。以大腸桿菌-黃色短桿菌穿梭表達(dá)載體pDXW-10為基礎(chǔ),構(gòu)建重組質(zhì)粒pDXW-10-ilvBNr,并轉(zhuǎn)化野生型黃色短桿菌B.flavum ATCC14067,獲得工程菌株ATCC14067/pDXW-10-ilvBNr。