硅酸二鈣涂層離子溶液促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 目的:從人骨髓中分離培養(yǎng)hMSCs并對其細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行觀察。
　　 方法:無菌條件下在健康志愿者髂棘處穿刺抽取骨髓，運(yùn)用密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，再利用貼壁篩選法純化獲得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，對其進(jìn)行細(xì)胞生長和形態(tài)學(xué)的觀察，流式細(xì)胞儀檢測第3代hMSCs細(xì)胞表面標(biāo)志并分析細(xì)胞周期。
　　 結(jié)果:所分離培養(yǎng)出的細(xì)

2、胞形態(tài)呈長梭形，漩渦狀生長，純度隨傳代次數(shù)增加而提高，8代以后細(xì)胞擴(kuò)增速度變慢，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生改變。P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD90、CD105表達(dá)強(qiáng)陽性，而CD34、CD11b陰性。第1、3、5代hMSCs生長曲線呈S形，無顯著性差異，均經(jīng)歷潛伏期、對數(shù)增殖期和停滯期三個(gè)時(shí)期。培養(yǎng)的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞比例約為77.42％，處于S+G2/M期的細(xì)胞比例為22.58％左右。
　　 結(jié)論:采用密度

3、梯度離心結(jié)合貼壁篩選培養(yǎng)法可獲得純度較高且增殖活性強(qiáng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是一種簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
　　 第二部分硅酸二鈣涂層離子溶液對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及凋亡的影響
　　 目的:通過硅酸二鈣涂層離子溶液與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，試圖闡明硅酸二鈣涂層離子溶液對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的影響。
　　 方法:將等離子噴涂的硅酸二鈣涂層鈦片浸泡在DMEM培養(yǎng)基中，3

4、7℃下靜置72小時(shí)，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀(ICP)測定培養(yǎng)基中Si、Ca、P離子濃度的變化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別培養(yǎng)在四種培養(yǎng)基(OS-DS-、OS-DS+、OS+DS-、OS+DS+)中，MTT法測定細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測hMSCs位于G0/G1、S、G2/M期的細(xì)胞數(shù)及增殖指數(shù)、細(xì)胞凋亡率。
　　 結(jié)果:與OS-DS-培養(yǎng)基相比，OS-DS+、OS+DS+培養(yǎng)基中Si離子濃度顯著升高(P<0.05)；OS-D

5、S+、OS+DS-和OS+DS+培養(yǎng)基中Ca離子濃度略有下降，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；OS+DS-、OS+DS+培養(yǎng)基中P離子濃度明顯增高。在培養(yǎng)的1-4天，OS-DS+和OS+DS+組細(xì)胞增殖率高于OS-DS-組，并分別在第2、3天時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；OS+DS-組的細(xì)胞數(shù)始終低于OS-DS-組，在第7天時(shí)有顯著性差異(P<0.05)。流式細(xì)胞儀測定結(jié)果顯示，在第4天時(shí)，OS-DS+和OS+DS+組處于G0/G1期的細(xì)胞比例明顯低于OS-

6、DS-組，G2/M期細(xì)胞比例明顯高于OS-DS-組(P<0.05)；OS+DS-組處于S期的細(xì)胞數(shù)在第4天時(shí)比OS-DS-組明顯減少，而OS+DS+和OS-DS+組S期的細(xì)胞比例分別在第4、14天明顯高于OS-DS-組。和OS-DS-組比較，OS+DS-和OS+DS+組細(xì)胞凋亡率在第7、14天顯著增高，而OS-DS+組細(xì)胞凋亡率在第14天明顯高于OS-DS-組(P<0.05)。
　　 結(jié)論:硅酸二鈣涂層離子溶液能促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)

7、干細(xì)胞的早期增殖，其促細(xì)胞增殖的能力可能與培養(yǎng)基中較高的硅離子濃度有關(guān)，通過加速骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換而達(dá)到的。
　　 第三部分硅酸二鈣涂層離子溶液促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究
　　 目的:通過檢測骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中特異性基因的表達(dá)，探討硅酸二鈣涂層離子溶液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。
　　 方法:人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別培養(yǎng)在四種培養(yǎng)基(OS-DS-、OS-DS+、OS+DS-、OS

8、+DS+)中，采用對硝基苯磷酸鹽法測定細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)活性，茜素紅S染色方法觀察鈣化結(jié)節(jié)的形成，以半定量RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Ⅰ型膠原、骨結(jié)合素及骨鈣素的基因表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:在整個(gè)培養(yǎng)過程中OS+DS-、OS+DS+組ALP活性顯著高于OS-DS-和OS-DS+組；在第7、14和21天時(shí)，OS+DS+組細(xì)胞內(nèi)ALP活性明顯高于OS+DS-組；從第7天起，OS-DS+組ALP活性高于OS-DS-組，

9、并于第14天時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在培養(yǎng)的第14天，OS-DS+、OS+DS-和OS+DS+組鈣沉積的OD值均高于OS-DS-組，有顯著性差異(P<0.05)；與OS+DS-組相比，OS+DS+組鈣沉積的OD值明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。培養(yǎng)28天后，OS+DS+組鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量和著色程度均較OS+DS-組明顯增加，其他兩組未見鈣化結(jié)節(jié)形成。在第4、7、14天時(shí)，成骨誘導(dǎo)組hMSCs成骨分化相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)量顯著高于

10、非成骨誘導(dǎo)組；OS-DS+組Runx2與骨結(jié)合素mRNA表達(dá)水平分別在第7、14天明顯高于OS-DS-組；在第14天，OS+DS+組各特異性基因的表達(dá)量均顯著高于OS+DS-組。
　　 結(jié)論:硅酸二鈣涂層離子溶液自身能夠在一定程度上誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化；和成骨誘導(dǎo)劑協(xié)同，則促進(jìn)鈣沉積及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。
　　 第四部分硅酸二鈣涂層離子溶液促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制的研究
　　 目的

11、:探討硅酸二鈣涂層離子溶液促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的可能分子機(jī)制。
　　 方法:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別培養(yǎng)在三組培養(yǎng)基(OS+DS-、OS+DS+、OS+DS+/PD)中，以Western blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)ERK的磷酸化表達(dá)情況；加入ERK特異性抑制劑PD98059后，分別采用對硝基苯磷酸鹽法、茜素紅S染色方法測定堿性磷酸酶活性與鈣沉積變化。
　　 結(jié)果:與OS+DS-組相比，在第7、14及21天，OS+DS+

12、組細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性顯著增加(P<0.05)，其作用可被ERK途徑抑制劑PD98059阻斷(P<0.01)。OS+DS+組鈣沉積在第14天時(shí)明顯高于OS+DS-組(P<0.05)，其作用也可被PD98059抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。hMSCs受到OS+DS+培養(yǎng)基作用后10 min，細(xì)胞中磷酸化的ERK表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)，并維持在較高水平至60min，隨后磷酸化的ERK表達(dá)逐漸降低到基線水平。比較三組培養(yǎng)基作用10 min后