脂肪酶PaL和R-2-氯丙酸脫鹵酶dehDIV-R的結(jié)晶及手性識(shí)別過程研究.pdf

1、脂肪酶和脫鹵酶是水解酶中重要的兩大類。脂肪酶PaL能對(duì)四對(duì)外消旋薄荷醇丙酸酯進(jìn)行選擇性水解得到三-薄荷醇，脫鹵酶dehDIV-R能對(duì)消旋2-氯丙酸進(jìn)行選擇性水解從而得到光學(xué)純的S-2-氯丙酸，兩酶均具有重要的應(yīng)用前景。但目前其蛋白結(jié)構(gòu)尚未確定，手性識(shí)別過程也不明確，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和手性識(shí)別研究具有重要意義。
　　首先利用已構(gòu)建的重組菌（PaL菌株），可溶性表達(dá)脂肪酶PaL，并通過蛋白純化條件的篩選，利用親和鎳柱、Superdex

2、TM75 prep grade凝膠柱和GE MiniSPC3.2/3陽離子交換柱等進(jìn)行層析法純化，得到高純度的蛋白;然后利用座滴氣相擴(kuò)散法，在18℃和4℃初篩得到蛋白單晶。對(duì)18℃初篩的晶體進(jìn)行優(yōu)化，最終在Tris-HCl(pH8.25)，PEG400032％，0.3％蔗糖，0.2 M NDSB-201條件下得到用于衍射的晶體。在結(jié)晶母液中添加10％的甘油作為冷凍保護(hù)液，在R-axis(Ⅳ)++(Rigaku)上收集數(shù)據(jù)，經(jīng)HKL200

3、0處理后分辨率截取在2.5(A)，每一個(gè)不對(duì)稱單元含有兩個(gè)蛋白分子，空間群為P21212。然后利用單波長(zhǎng)反常散射法(Se-MAD)解決晶體結(jié)構(gòu)解析中的相角問題。在培養(yǎng)基中完全用硒代甲硫氨酸代替甲硫氨酸培養(yǎng)細(xì)菌以產(chǎn)生含硒代甲硫氨酸的蛋白質(zhì)，達(dá)到硒取代硫的目的，得到的硒代蛋白采用母體蛋白相同的純化方式，再利用座滴氣相擴(kuò)散法，在4℃初篩得到蛋白單晶。對(duì)初篩的晶體進(jìn)行優(yōu)化，最終在PEG335024％，0.2 M檸檬酸鉀條件下得到質(zhì)量較好的晶體。

4、在上海同步輻射光源(SSRF)的B17U線站上收集數(shù)據(jù)。經(jīng)HKL2000處理后截取的分辨率為2.3(A)（圖2.17），每一個(gè)不對(duì)稱單元含有兩個(gè)蛋白分子，空間群仍然是P21212。但遺憾的是從HKL2000處理結(jié)果中未觀察到Se的反常散射信號(hào)。
　　接著本文利用已構(gòu)建的重組菌（dehDIV-R菌株），可溶性表達(dá)脫鹵酶dehDIV-R，并通過蛋白純化條件的篩選，利用親和鎳柱、SuperdexTM75 prep grade凝膠柱和GE

5、 Mini QPC3.2/3陰離子交換柱等純化手段，得到高純度的蛋白;然后在4℃下利用座滴氣相擴(kuò)散法進(jìn)行初篩晶體，優(yōu)化后在0.1M Bis-Tris propane(pH8.5)，20％ PEG3350，0.2M氟化鈉條件下晶體質(zhì)量有所改善。
　　最后以dehDIV-R為模型，研究了R-2-鹵代酸脫鹵酶的手性識(shí)別過程。首先通過測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的構(gòu)型，確定dehDIV-R催化底物為SN2反應(yīng)。通過DiscoveryStudio3.0對(duì)d