果蠅SNARE蛋白Sec22對細胞內(nèi)膜泡運輸調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的:真核細胞內(nèi)的膜泡運輸對于細胞的多種生命活動至關(guān)重要并受到精密調(diào)節(jié)。膜泡運輸?shù)漠惓е掳l(fā)育障礙和多種人類疾病。本研究以果蠅為模式生物，首先用甲磺酸乙酯(EMS)誘變法處理果蠅，篩選到了影響細胞內(nèi)膜泡運輸?shù)腟ec22突變體，進而探討了SNARE蛋白Sec22在果蠅細胞內(nèi)膜泡運輸中的調(diào)節(jié)作用，首次揭示了Sec22的在體功能。
　　方法:利用FRT/FLP系統(tǒng)在突變體果蠅脂肪體中制造并標記突變克隆，并在脂肪體中用GFP標記膜泡運輸

2、中的轉(zhuǎn)運小泡和細胞器。激光共聚焦顯微鏡下觀察對比突變克隆細胞與野生型細胞中GFP的差異;然后利用eyFLP/FRT系統(tǒng)在果蠅眼睛中制造突變克隆，并借助電鏡觀察突變細胞內(nèi)膜泡數(shù)量變化和形態(tài)特征:最后采用免疫共沉淀法揭示Syntaxin5、Eyc和Sec22三者之間的關(guān)系，探尋Sec22作用的分子機制。
　　結(jié)果:(1)我們篩選到X染色體純合致死的突變基因Sec22，該基因突變體果蠅死于胚胎期。(2)激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，Sec2

3、2突變細胞中積累大量的KDEL-GFP(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))、Rab7-GFP（晚期內(nèi)涵體）和LAMP-GFP（溶酶體），MANⅡ-GFP標記的高爾基體形態(tài)異常。(3)電鏡的結(jié)果顯示，Sec22突變體眼睛光感受細胞嚴重損傷，細胞結(jié)構(gòu)不完整，rhabdomere之間有融合現(xiàn)象，細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度增生。并且Syntaxin5 RNAi以及已報道過的Eyc過表達果蠅眼睛的表型與Sec22突變體表型極為相似。(4) Syx5與Sec22有相互作用，Sec22