ebv抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑

1、EB病毒IgA抗體酶聯(lián)免疫吸附法診斷試劑盒（受理號：X0407269 ）,中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院朱振宇教授、醫(yī)學(xué)博士、博士生導(dǎo)師中山大學(xué)達(dá)安基因股份首席科學(xué)家,一、鼻咽癌與EB病毒感染的關(guān)系,◆鼻咽癌（NPC）是來源于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的低分化或未分化癌。本病可見于世界各地，但NPC有明顯的種族傾向，大部分患者是中國人及其后裔，在愛斯基摩人、北非洲人和馬來人中也較常見。 ◆ 病人的腫瘤細(xì)胞中有規(guī)律地隱匿著潛伏狀態(tài)的EB病毒（Epst

2、ein-Barr Virus，EBV）。,1、病人的腫瘤細(xì)胞中隱匿著EB病毒,◆ 發(fā)現(xiàn) EB病毒是1964年Epstein與Barr在非洲兒童惡性淋巴瘤的瘤細(xì)胞中觀察到的一種皰疹病毒。 1966年Old等采用免疫擴(kuò)散法發(fā)現(xiàn)鼻咽癌病人的血清能與非洲兒童淋巴細(xì)胞的抽提液起反應(yīng)。,1、病人的腫瘤細(xì)胞中隱匿著EB病毒,◆ 證據(jù)（1）： 1969年de-the從鼻咽癌活檢培養(yǎng)的類淋巴細(xì)胞中分離出EB病毒。

3、國內(nèi)也已經(jīng)從鼻咽癌組織培養(yǎng)所建立的類淋巴母細(xì)胞株中證明帶有EB病毒殼抗原（VCA）和早期抗原（EA），并在電鏡下找到了典型的皰疹病毒顆粒，其形態(tài)與EB病毒相同。,1、病人的腫瘤細(xì)胞中隱匿著EB病毒,◆ 證據(jù)（2）： Kottaridis SD等（2019年）認(rèn)為鼻咽癌患者血清中抗EBNA的水平反映腫瘤的大小 。[Anticancer Res,2019,16(2):785-789] Vera-Sempere F

4、J等（2019年）采用巢式PCR和免疫組化分析說明了不論組織學(xué)類型，鼻咽癌中均有EB病毒感染。 [Eur J Cancer B Oral Oncol,2019,32B(3):163-168],2、幾乎100%鼻咽非角化性癌均有EBV感染。,在我國，幾乎所有四歲以上的人群均已感染過EBV，80%以上的健康成人是EBV攜帶者。特別在珠江三角洲及香港地區(qū)，是世界上NPC的高發(fā)區(qū)。 根據(jù)中山市的腫瘤統(tǒng)計資料（流行病學(xué) ），NPC的年

5、齡和性別的校正發(fā)病率為18.12/10萬 (男：25.60 /10萬；女：11.05/10萬)。97%的NPC為非角化性癌。經(jīng)EBER1原位雜交（所謂“金標(biāo)準(zhǔn)” ）證實癌細(xì)胞中有EBV感染。,EBERs原位雜交,3、NPC病人血清中的EBV抗體水平普遍升高,◆ NPC的顯著特征是病人血清中對EB病毒各種抗原的抗體（尤其是IgA亞型）水平普遍升高，借此可區(qū)分NPC與健康攜帶者。（ Werner Henle et al., 1976. ）

6、 ◆中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院等單位采用間接免疫熒光法，發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者血清中IgA/VCA的陽性率為90.14％，幾何平均滴度為1:15.3,而其它癌瘤和健康攜帶者血清中IgA/VCA的陽性率為2.61%-3.30% ，幾何平均滴度為1:1.3。同時還發(fā)現(xiàn)鼻咽癌病人放療后，其IgA抗體水平隨存活時間的延長而逐漸下降，在放療后 4～22年者僅39.29％為陽性；但當(dāng)病者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時，陽性率又再次升至85.75％。,一、鼻咽癌與EB病毒感

7、染的關(guān)系,小結(jié)：流行病學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)的資料證實, EBV感染與NPC有密切關(guān)系。 ◆鼻咽癌患者癌細(xì)胞中證實有EB病毒的DNA，經(jīng)原位雜交，多數(shù)癌細(xì)胞呈EBERs陽性、核抗原（EBNA-1）陽性。 ◆鼻咽癌患者腫瘤細(xì)胞中有EB病毒，血清有一套抗EB病毒的抗體，血清中的EBV抗體水平普遍升高。 ◆ 2019年世界衛(wèi)生組織在國際抗癌聯(lián)盟年會上把EBV歸類為第一類致癌物（特別是鼻咽癌） 。,二、EB病毒攜帶者與鼻咽癌病人血

8、清中EBV抗體的不同,◆ EBV血清學(xué)診斷利用NPC的一個特征，即患者多種EBV抗體的水平較非患者高（Werner Henle et al.,1976.）。 ◆ EBV血清學(xué)診斷已用于NPC高危人群的篩查和對NPC可疑病例的診斷。根據(jù)從70年代后期以來的研究結(jié)果，VCA-IgA檢測通常被用于篩查以排除NPC的診斷 ；EA-IgA檢測目前被用于NPC的確定性檢測。,二、EB病毒攜帶者與鼻咽癌病人血清中EBV抗體的不同,檢測哪種抗體？檢

9、測抗體哪種類型？,,因為鼻咽癌（NPC）是來源于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的低分化或未分化癌。 所以我們可以先了解EB病毒在上皮細(xì)胞中的潛伏感染以及兩種形式的EB病毒感染所表達(dá)的各種抗原。 各種抗原相應(yīng)產(chǎn)生不同的特異性抗體中哪種有代表性？,1、 EB病毒的潛伏感染,上皮細(xì)胞中病毒復(fù)制→循環(huán)中的B淋巴細(xì)胞池→ 長期潛伏感染 ↑

10、 ↑如果感染了無復(fù)制缺陷突變的病毒 ↑EB病毒→感染口咽上皮細(xì)胞 ↑如果感染了復(fù)制缺陷突變的病毒 ↑ ↓

11、 ↑ 待上皮細(xì)胞增生后→個別細(xì)胞死亡→EB病毒引自: J Immmunol. 2019; 17498:4972-8,2、兩種形式的EB病毒感染,◆潛伏性感染(latent infection)I型潛伏性感染: 表達(dá)EBNA1，病征為 Burkitt 淋巴瘤II型潛伏性感染:表達(dá)EBNA1和LMP1、LMP2A、LMP2B，病征為Hodgkin

12、 淋巴瘤、鼻咽癌、鼻型 NK/T-細(xì)胞淋巴瘤、 T-細(xì)胞淋巴瘤III型潛伏性感染:表達(dá)EBNA1、EBNA2、EBNA3、EBNA4、EBNA5、 EBNA6，病征為傳染性單核細(xì)胞增多癥、移植后淋巴 組織增生性疾病◆溶解性感染(lytic infection)

13、 在EBV潛伏感染的淋巴細(xì)胞中有小部分（約15%～20%）出現(xiàn)溶解性感染，溶解性感染出現(xiàn)三個時相（phase）。 立即早期: 表達(dá)Zta(ZEBRA)、EBNA1等 早期: 表達(dá)EA(D)、EA (R) 、 EBNA1等 晚期: 表達(dá)VCA、EBNA1等◆EBNA-1 是在所有不同EB

14、V感染細(xì)胞中都出現(xiàn)的唯一抗原。,3、檢測抗體哪種類型？,遵循免疫學(xué)抗體產(chǎn)生的基本原則◆ IgG◆ IgM◆ IgA是上皮細(xì)胞的分泌型抗體◆ IgD◆ IgE,二、EB病毒攜帶者與鼻咽癌病人血清中EBV抗體的不同,NPC病人血清中的EBNA1/IgA抗體平均水平是健康攜帶者的4倍以上。,EBNA 1 IgA 的抗體水平在NPC患者中高于正常的EBV攜帶者,Cutoff OD?,小結(jié),◆NPC主要表現(xiàn)是EBV潛伏感染伴少量溶解性

15、感染。 EBNA-1 是在所有不同EBV感染細(xì)胞中都出現(xiàn)的唯一抗原?！鬘PC是來源于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞，檢測上皮細(xì)胞的分泌型IgA抗體水平對NPC較有診斷意義。◆ NPC的顯著特征是病人血清中的EBV抗體（尤其是IgA亞型）水平普遍升高，這種變化在NPC發(fā)病前期將先于癥狀出現(xiàn)，借此可區(qū)分NPC與其它EB病毒感染相關(guān)疾病或健康攜帶者?！粑覀冋J(rèn)為EBNA1/IgA抗體水平的檢測對NPC高危人群的篩查可作為早期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌的有效手段之一。,

16、三 本品是用于NPC 輔助診斷的有效手段,◆NPC是來源于鼻咽粘膜上皮細(xì)胞的一種惡性腫瘤，組織病理學(xué)檢查是確診NPC的唯一方法?！?NPC的早期癥狀是非特異的，EBV血清學(xué)體外診斷最常用于診斷程序的初期及NPC高危人群的篩查?！?NPC的顯著特征是病人血清中的EBV多種抗體水平普遍升高，因此一種抗體的檢測有一定的局限性?！舯酒返脑O(shè)計應(yīng)用ELISA技術(shù) ，采用了高度純化的EBNA 1的抗原 ，它的抗體水平在鼻咽癌和非鼻咽癌患者之間的

17、差異，大于那些不是由腫瘤細(xì)胞所表達(dá)的抗原的特異性抗體。同時每個試劑盒中加入了一份定值參考對照，在每次的檢測中與測試樣品同時進(jìn)行檢測，使抗體的水平以標(biāo)準(zhǔn)的rOD單位來表示 ，這樣可以減少實驗之間和實驗室之間的誤差，從而可以直接地比較不同的實驗室在不同的時間所獨立得出的檢測結(jié)果。,1、本品的用途和局限性,◆ 用途 本品適用于疑似鼻咽癌病人的血清學(xué)檢測，檢測結(jié)果有助于臨床醫(yī)生作出排除或進(jìn)一步確認(rèn) NPC 的診斷。

18、 主要可用于高危人群的篩查。◆局限性 本品并非NPC診斷的確診試劑，只有組織病理學(xué)檢查能確診NPC。 檢測結(jié)果只提供了額外的信息，以指導(dǎo)對疑似NPC病例的診斷。同時對健康人群來說，檢測結(jié)果可能反映NPC的風(fēng)險程度。,2、本品的使用特點,推薦使用的診斷參數(shù)及其臨床意義：◆當(dāng)疑似鼻咽癌癥狀的病人首次到?？崎T診就診時，血清學(xué)診斷可作初步篩選，此時敏感性為主要的診斷參數(shù)。其目的是評估病人被診斷為鼻

19、咽癌的可能性大小。推薦使用當(dāng) rOD值低于0.700時，可判定為陰性（此時敏感性大于94.1%），支持排除NPC，但應(yīng)建議病人定期復(fù)查；◆當(dāng)普查時，絕大部分人均非鼻咽癌患者，因此特異性為主要的診斷參數(shù)。推薦使用當(dāng) rOD值高于1.500時，可判定為陽性（此時特異性大于94.4%），即高度懷疑病人患有NPC，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行組織學(xué)檢查以確診。◆當(dāng)rOD值在0.700至1.500之間時，判定為可疑NPC（此時敏感性和特異性在70%~95%之間

20、），須結(jié)合臨床作進(jìn)一步檢查和隨訪，必要時進(jìn)行組織學(xué)檢查。,3、本品的判斷依據(jù)和評價,◆相對抗體水平與罹患NPC的關(guān)系 ： 對1402例2019年以來在NPC高發(fā)區(qū)普通門診和耳鼻喉科就診病人的血清進(jìn)行檢測，其相對抗體水平（rOD）與罹患NPC的關(guān)系見下表。1402例病人中有321例經(jīng)組織學(xué)檢查確診為NPC，其他1081例臨床經(jīng)多種血清學(xué)方法或組織學(xué)方法檢查，結(jié)合臨床觀察，不能確診為NPC，應(yīng)考慮排除NPC。,表 NPC高發(fā)區(qū)1

21、402例疑似病人相對抗體水平與罹患NPC的關(guān)系,注：陽性試驗似然比（LR＋）= 敏感性 ∕ ( 1－特異性 ),EBNA1-IgA ELISA 檢測結(jié)果的最優(yōu)化選擇,特異度 [controls],敏感度 [NPC],低 / 高,rOD值,百分比,臨床考核試驗評價（1）,三個醫(yī)療單位的非鼻咽癌個體的抗體水平相似，并且明顯低于鼻咽癌患者的抗體水平。詳見下表,臨床考核試驗評價（2）,三個醫(yī)療單位的檢測中，敏感性和特異性的水平相似。詳見下表,臨

22、床考核試驗評價（3）,進(jìn)行了VCA IgA 和EA IgA的免疫熒光檢測以及EBV DNA檢測對比 ?！糇鳛楹Y查實驗排除鼻咽癌的應(yīng)用與VCA IgA相比較,◆作為確定實驗預(yù)測鼻咽癌的應(yīng)用與EA IgA 和EBV DNA檢測相比較,◆結(jié)果表明，本品在篩查試驗中的應(yīng)用與目前所使用的VCA IgA相似，在確定實驗中的應(yīng)用與目前所使用的EA IgA，或與最新使用的EBV DNA檢測相似。,小結(jié),臨床考核檢測441例鼻咽癌患者，1523例非鼻咽

23、癌患者?？己私Y(jié)果顯示：◆以R≤0.7為臨界值（與目前所使用的VCA IgA相似 ），本品檢測陰性符合率為94%。假陰性率為6%；特異性為69%，假陽性31%?！粢訰≥1.5為 臨界值（與目前所使用的EA IgA ），本品檢測的陽性符合率為66%，假陽性率為6%，特異性94%，假陰性34%。 ◆上述結(jié)果與本品的使用說明書推薦使用的診斷參數(shù)及其臨床意義相一致。,中國藥品生物制品檢定所藥品注冊檢驗報告,報告編號：SZ201901144,