重金屬鉛人工抗原的制備與純化及抗體免疫檢測體系的建立.pdf

1、重金屬鉛是具有持續(xù)毒性的有害物質(zhì),在自然環(huán)境中很難通過生物、化學(xué)方式降解轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì);通過飲食進(jìn)入人體后,則會在人體內(nèi)富集引起中毒,因此各國均對重金屬鉛在環(huán)境與食品中的殘留量有明確的、嚴(yán)格的限制。ELISA檢測方法相對原子吸收法、電感偶聯(lián)等傳統(tǒng)重金屬鉛檢測方法,具有經(jīng)濟(jì)、快速、便捷等優(yōu)勢,高特異性重金屬鉛人工抗原和抗體的研制是建立重金屬鉛酶聯(lián)免疫快速檢測的關(guān)鍵。本研究通過對制備的重金屬鉛人工抗原的純化,提高人工抗原免疫效果,免疫Bal

2、b/c小鼠,制備抗鉛單克隆抗體,具體如下:
　　 1)重金屬鉛人工抗原的制備
　　 在重金屬鉛人工抗原制各過程中,本實驗選取[(R)-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙基1-(S-S)環(huán)己烷-1,2二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-Chx-A"-Dtpa)作為雙功能螯合劑,并對重氮化法、傳統(tǒng)戊二醛法和改良戊二醛法進(jìn)行了比較。重氮化法合成的抗原偶聯(lián)率相對較高,最高可以達(dá)到1:47,但是沉淀產(chǎn)生嚴(yán)重,同時,通過實驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)偶聯(lián)

3、比接近1:21左右時,人工抗原溶液就極易產(chǎn)生絮狀沉淀,并且離心后,沉淀依然存在,無法應(yīng)用于后期的動物免疫實驗,另外,重氮化法反應(yīng)條件劇烈,容易造成載體蛋白變性,從而減弱甚至其喪失免疫原性。傳統(tǒng)戊二醛法,雖然條件溫和,抗原反應(yīng)液澄清,但是其合成的抗原偶聯(lián)率相對較低,一般只有1:14左右,因此,研究對傳統(tǒng)戊二醛法加以改進(jìn),在使用相同螯合劑的情況下將偶聯(lián)率提高到1:20左右。
　　 2)重金屬鉛人工抗原的純化
　　 人工抗原的

4、純度是影響免疫效果的重要因素之一,免疫抗原純度越高,誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的可能也越高。在人工抗原制備過程中,容易出現(xiàn)蛋白鏈接蛋白的現(xiàn)象,若這種情況發(fā)生比較嚴(yán)重,則會對抗原鑒定結(jié)果帶來很大干擾,而且對產(chǎn)生抗體的特異性帶來不利影響。本實驗選用濾膜孔徑較大的超速離心管,去除抗原溶液中分子量過大的交聯(lián)蛋白,通過SDS-PAGE電泳檢測,表明抗原純度有明顯提高,且由于無效蛋白的去除,抗原偶聯(lián)比進(jìn)一步提高,由1:20提高至1:23。
　　

5、 3)重金屬鉛免疫檢測方法的建立
　　 將重金屬鉛免疫檢測方法的實驗條件進(jìn)行優(yōu)化,為建立高效、準(zhǔn)確的重金屬鉛抗體ELISA檢測方法打下基礎(chǔ)。本實驗在原有ELISA檢測方法的基礎(chǔ)上,對實驗中使用的緩沖液類別、溶液pH值、檢測用包被抗原的包被時間及溫度等條件參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,最終結(jié)果表明,實驗用緩沖液選用HBS緩沖液,并將pH值調(diào)整至7.4效果最好;包被抗原的包被時間在環(huán)境溫度37℃時為1小時,當(dāng)環(huán)境溫度為4℃時包被時間為12小時為宜。

6、
　　 4)抗重金屬鉛單克隆抗體的制備與鑒定
　　 本實驗選用5～8周齡的Balb/c雌性小鼠進(jìn)行動物免疫實驗。將(1)中制備的重金屬鉛人工抗原用皮下多點注射的方式免疫小鼠,第四次免疫后,得到效價在1:102400至1:204800之間的小鼠血清,通過計算,不同種類包被抗原OD值的差異率達(dá)到131％,證明小鼠已對抗原產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,并產(chǎn)生抗體。取陽性小鼠脾細(xì)胞與飼養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞融合,細(xì)胞融合率達(dá)85.91%,單克隆數(shù)