三株海洋微生物中胞外多糖的分離、結(jié)構(gòu)和抗氧化活性研究.pdf

1、海洋微生物由于其特殊的生存環(huán)境，具有產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能獨特的新型活性胞外多糖的潛力，是開發(fā)多糖類海洋新藥的重要資源。 近年來，海洋微生物胞外多糖作為活性物質(zhì)的新來源，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域正日益受到人們的關(guān)注。本論文以12種海洋微生物發(fā)酵液提取的胞外多糖為研究對象，并對其產(chǎn)率、理化性質(zhì)、單糖組成和抗氧化活性進(jìn)行研究，從中篩選出深海真菌Penicillium sp．、海綿共附真菌Epicoccum nigrum和海洋放線菌THW-7A胞外

2、多糖，并進(jìn)一步分離純化，深入研究其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和抗氧化活性。 以LEPS、JEPS和WEPS為研究對象，采用離子交換色譜和凝膠排阻色譜相結(jié)合對其進(jìn)行分離純化分別得到八種胞外多糖LEPS1-1、LEPS1-2、LEPS-2、JEPS-1、JEPS-2、WEPS-1、WEPS-2和WEPS-3。經(jīng)Shodex OH pak SB-804柱高效液相色譜分析，證明八種多糖都具有較高的純度。通過采用高碘酸氧化-Smith降解、甲基化等化

3、學(xué)方法及現(xiàn)代儀器分析手段，包括IR、GC、HPGPC、HPLC、GC-MS、NMR等，分別對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入研究，確定了它們的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)特點。 結(jié)果表明：LEPS1-1主鏈?zhǔn)且?→2，1→6連接Man，其摩爾比近似為2：1，支鏈中主要為1→3連接的Glc，同時存在微量的1→2，4連接的Gal；LEPS1-2主鏈?zhǔn)?→2 Man和1→4 Man摩爾比近似1：1比例連接，支鏈?zhǔn)?→2，4 Gal為主，還含有較多的末端甘露糖和少量的

4、1→6 Man、1→2 Gal；LEPS-2結(jié)構(gòu)中主鏈?zhǔn)?→2 Man，1→6 Glc，而其支鏈?zhǔn)且?→2，4 Gal和1→4 Man為主。JEPS-1主鏈主要為1→2 Man，1→3 Man和1→2，3 Gal，支鏈為1→6Glc、1→4 Glc和1→3，6連接的Glc，同時存在大量1→Man。JEPS-2主鏈?zhǔn)?→4 Gal、1→6 Glc和1→3，6 Glc，支鏈?zhǔn)?→2 Glc，還含有較多的末端甘露糖和少量的1→3 Man、1→

5、2，3 Gal。WEPS-1的主鏈主要為1→2Man、1→3Man和1→2，3Man，并且摩爾比近似等于5：5：3，同時含有大量的末端Man和少量的1→6甘露糖。而WEPS-2主鏈主要是1→2Man、1→6Glc、1→3Glc、1→2，3Man和1→3，6Man，支鏈主要是1→Man和1→Glc鍵型。WEPS-1和WEPS-2的結(jié)構(gòu)相對簡單，均是分支度很少的近似直鏈的結(jié)構(gòu)。 采用溫和的0.01 mol L-1 HCl在60℃降解

6、3小時作為降解條件制備WEPS-3系列寡糖，利用HPGPC-RID經(jīng)Bio-Gel-P4凝膠柱對降解產(chǎn)物進(jìn)行分離制備獲得寡糖，在線示差檢測到8個寡糖組分(F2～F9)，并對全排阻部分在相同條件下降解和純化得到7個寡糖組分(f2～f8)。將胞外多糖WEPS-3和獲得的寡糖組分進(jìn)行紅外光譜分析，結(jié)果表明分離得到的寡糖與原料多糖的譜圖十分相似，各種糖的特征吸收峰均未發(fā)生明顯改變，并通過ESI-MS分析確定了各組分的分子量大小，測定結(jié)果為F2～

7、F7的分子量分別為268 Da、518 Da、768 Da、1018 Da、1268 Da和1518 Da，f2～f4的分子量分別為268 Da、518 Da和768Da，結(jié)果證實F2～F7分別為聚合度1到6的糖單元，f2～f4分別為聚合度為1～3的糖單元。 同時結(jié)合1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H1H-COSY、HMQC、HMBC和ESI-CID-MS/MS等儀器分析手段對F2和F3片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)和序列解析，結(jié)果表明

8、胞外多糖WEPS-3為α-2→8連接的聚合度為25的脫氨基神經(jīng)氨酸Kdn。這是首次報道從海洋放線菌THW-7A中獲得多聚Kdn唾液酸，此研究對海洋微生物胞外多糖的研究具有重要的參考價值。Kdn是唾液酸中神經(jīng)氨酸(Neuraminic acid)的衍生物。 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)根據(jù)某些身體的化學(xué)水平來臨床診斷和治療疾病，Kdn被證明和多種疾病有關(guān)，例如腫瘤、癌癥、糖尿病、心血管疾病等；有人甚至認(rèn)為它們和進(jìn)化有關(guān)，能增強生物體對環(huán)境的適應(yīng)性。近

9、期食品安全方面更進(jìn)一步強調(diào)了唾液酸的作用。據(jù)研究，母乳中唾液酸化的成分能幫助嬰兒抵抗腸道感染以及促進(jìn)記憶和智力的發(fā)育。但是作為母乳替代品的牛乳里面的唾液酸含量要大大低于母乳。 通過利用Fenton反應(yīng)檢測對羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除能力以及抗脂質(zhì)過氧化和還原能力等實驗對八種胞外多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，并與陽性對照BHT和Vc進(jìn)行比較。 結(jié)果表明，JEPS-1和JEPS-2均表現(xiàn)出很強的抗氧

10、化活性； LEPS1-1，LEPS1-2和LEPS-2對清除超氧陰離子和抗脂質(zhì)過氧化的能力異常顯著；WEPS-1、WEPS-2和WEPS-3抗脂質(zhì)過氧化能力也非常強，其EC50值分別為0.59、0.43和0.34，并可與陽性對照Vc相比擬。 酸性多聚糖的抗氧化活性均高于中性多聚糖，推斷這可能與酸性多糖含有較多的帶負(fù)電荷的糖醛酸有關(guān)，另外糖單元的類型和糖苷鍵的構(gòu)型，多糖的取代基，多糖的空間結(jié)構(gòu)，多糖的分子量大小等也是影響多糖抗氧化