海洋微生物乳化活性物質(zhì)和高溫微生物脫硫的研究.pdf

1、20世紀(jì)初人們發(fā)現(xiàn)有一些微生物能夠降解水體中的油污染物，目前，石油污染物的微生物降解已經(jīng)從微生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論進(jìn)入了以生物修復(fù)為主的實(shí)際應(yīng)用，生物乳化劑對(duì)于石油類水溶性低的污染物的生物降解具有促進(jìn)作用。 石油中的有機(jī)硫化物是其中的一類污染物，傳統(tǒng)的加氫脫硫方法(HDS)難以有效除去有機(jī)硫，成本高，操作困難。生物脫硫被認(rèn)為可以有效補(bǔ)充甚至取代HDS。該論文主要對(duì)深海環(huán)境中篩出的細(xì)菌產(chǎn)生的生物乳化劑的活性成分進(jìn)行了研究并且對(duì)高

2、溫脫硫菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析。 第一部分對(duì)2株模式不動(dòng)桿菌和本實(shí)驗(yàn)室分離的3株不動(dòng)桿菌產(chǎn)生的生物乳化劑的活性成分進(jìn)行了分析。 本文對(duì)3株深海沉積物來源的不動(dòng)桿菌和2株模式菌進(jìn)行了產(chǎn)生物乳化劑能力、活性成分及相關(guān)基因的分析，結(jié)果表明這些菌都能產(chǎn)生生物乳化劑。通過PCR檢測(cè)，5株菌中只有深海降解菌wp02421獲得了與乳化劑Emulsan產(chǎn)生密切相關(guān)的脂酶基因，氣質(zhì)聯(lián)用儀證明該菌所產(chǎn)的乳化劑含有脂肪酸組分，主要是正十六烷酸和

3、正十八烷酸，說明菌株wp02421產(chǎn)生的乳化劑與Emulsan類似，糖脂是主要成分之一。此外，通過PCR檢測(cè)，證明了5株不動(dòng)桿菌全部編碼外膜蛋白A基因(OmpA)。它們的氨基酸序列與Acinetobacter radioresistens KA53的乳化劑Alasan中的主要活性蛋白AlnA的同源性為71.26％-80.23％。以上結(jié)果表明，5株菌都能產(chǎn)生類似AlnA的乳化蛋白，而wp02421菌株同時(shí)還產(chǎn)生Emulsan中的糖脂。

4、 5株不動(dòng)桿菌全部編碼外膜蛋白A基因(OmpA)，我們將與Alasan蛋白同源性最高的wp02421 OmpA在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。用特異性引物Omp擴(kuò)增菌株wp02421 OmpA基因，將wp02421 OmpA全長(zhǎng)基因連接載體后導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，OmpA基因在大腸桿菌中大量表達(dá)，但是蛋白產(chǎn)物都是無活性的包涵體。 即使減少表達(dá)時(shí)間、降低表達(dá)溫度和降低IPTG的濃度，也不能使蛋白質(zhì)以可溶的有活性的形式存在。通過包涵體在

5、Ni-Agarose介質(zhì)上復(fù)性和純化，從菌體總蛋白中可以得到純化的重組蛋白，純化的重組蛋白對(duì)不同碳鏈長(zhǎng)度的烷烴有乳化活性，其中對(duì)正十六烷的乳化活性最強(qiáng)。 為了得到大量的可溶性分泌到胞外的蛋白質(zhì)，將不動(dòng)桿菌的外膜蛋白基因片段在酵母中表達(dá)。用引物Omp擴(kuò)增wp02421外膜蛋白全長(zhǎng)基因，EcoR Ⅰ和XbaⅠⅠ雙酶切片段，將wp02421 OmpA基因連接載體后轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。將wp02421擴(kuò)增的外膜蛋白片段在大

6、腸桿菌和酵母中進(jìn)行了表達(dá)，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行了乳化活性的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明酵母表達(dá)wp02421 OmpA只對(duì)正十六烷有乳化活性。目前，JCM6841，JCM6842，bme-3，bm-8 OmpA基因已經(jīng)載入質(zhì)粒中，線性話后電擊轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)，篩選出高效表達(dá)重組子，甲醇誘導(dǎo)酵母表達(dá)工作正在進(jìn)行之中，最后對(duì)wp02421菌的性質(zhì)進(jìn)行了研究。 第二部分是海洋脫硫微生物的研究。 用DBT為唯一硫源培養(yǎng)基對(duì)常溫脫硫菌和高溫脫硫菌進(jìn)

7、行篩選，篩出的菌種分別為DBT-1，DBT-2，DBT-3，DBT-4，DBT-601和DBT-602，其中DBT-1，DBT-2，DBT-3，DBT-4為常溫菌，DBT-601和DBT-602為60℃篩選出的高溫菌。經(jīng)16SrDNA分析，篩選出高溫脫硫菌都是芽孢桿菌，常溫脫硫菌分布在假單胞菌屬、紅球菌屬、短桿菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬。經(jīng)鑒定DBT-1和DBT-2都屬于芽孢桿菌屬，并且對(duì)高溫菌的最適生長(zhǎng)溫度進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)它們的最適生

8、長(zhǎng)溫度為60℃。本文研究高溫菌DBT-601將DBT降解途徑的方法是將培養(yǎng)液濃縮進(jìn)入GC-MS分析代謝產(chǎn)物，結(jié)果表明與傳統(tǒng)的4S途徑不同，DBT降解的經(jīng)典途徑為進(jìn)行4S途徑將DBT降解為2-羥基聯(lián)苯，而菌株DBT-601培養(yǎng)液中DBT的代謝產(chǎn)物為3-羥基-1，1聯(lián)苯。 這個(gè)途徑由dszA，dszB，dszC這三種單加氧酶催化，根據(jù)保守序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增高溫菌DBT-601，DBT-602的單加氧酶基因。沒有克隆到相關(guān)基因，可能代