雙重環(huán)介導(dǎo)等溫檢測大腸桿菌和副溶血弧菌方法建立.pdf

1、本研究針對大腸桿菌rfbE基因和副溶血弧菌pR72H基因分別設(shè)計(jì)了LAMP特異性引物，利用LAMP技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA，建立了大腸桿菌和副溶血弧菌的快速LAMP檢測技術(shù)，并初步應(yīng)用于食物樣品的檢測，主要研究結(jié)果如下。
　　1.建立并優(yōu)化了大腸桿菌LAMP反應(yīng)條件，并對引物特異性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明大腸桿菌最佳反應(yīng)條件為:25μL反應(yīng)體系中包含10μmol/L內(nèi)引物FIP-E和BIP-E各3.0μL，缺省外引物F3-E和B3-E，1

2、0μmol/LdNTP2.0μL，10×buffer2.5μL，100mmol/LMg2+0.5μL，DNA模版2.0μL，BstDNA聚合酶16U，雙蒸水10μL補(bǔ)足25μL，反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間60min，75℃保溫10min終止反應(yīng)。引物特異性實(shí)驗(yàn)表明，該引物能擴(kuò)增5株供試大腸桿菌，其他供試菌為陰性。在此條件下LAMP反應(yīng)對大腸桿菌的檢出限為100fg/反應(yīng)。
　　2.建立并優(yōu)化了副溶血弧菌LAMP反應(yīng)條件，并對引物特異

3、性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明副溶血弧菌最佳反應(yīng)條件為:25μL反應(yīng)體系中包含10μmol/L內(nèi)引物FIP-V和BIP-V各3.0μL，缺省外引物F3-V和B3-V，10μmol/LdNTP2.0μL，10×buffer2.5μL，100mmol/LMg2+0.5μL，DNA模版2.0μL，BstDNA聚合酶16U，雙蒸水10μL補(bǔ)足25μL，反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間60min，75℃保溫10min終止反應(yīng)。引物特異性實(shí)驗(yàn)表明，該引物能擴(kuò)增3株

4、供試副溶血弧菌，其他供試菌為陰性。在此條件下LAMP反應(yīng)對副溶血弧菌的檢出限為100fg/反應(yīng)。
　　3.大腸桿菌和副溶血弧菌的雙重LAMP檢測方法的建立
　　經(jīng)過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定了大腸桿菌和副溶血弧菌的雙重LAMP反應(yīng)的最佳條件為:25μL反應(yīng)體系中包含大腸桿菌內(nèi)引物FIP-E和BIP-E各3.0μL，副溶血弧菌內(nèi)引物FIP-V和BIP-V各3.0μL，缺省外引物F3-E和B3-E、F3-V和B3-V，10mmol/LdNTP

5、2.0μL，10×buffer2.5μL，100mmol/LMg2+0.5μL，大腸桿菌DNA模板2.0μL，副溶血弧菌DNA模板2.0μL，BstDNA聚合酶16U，雙蒸水2.0μL補(bǔ)足25μL，反應(yīng)溫度65℃，反應(yīng)時(shí)間60min，75℃保溫10min結(jié)束反應(yīng)。
　　此條件下雙重LAMP反應(yīng)檢測大腸桿菌和副溶血弧菌的靈敏度均達(dá)到100fg/反應(yīng)，是傳統(tǒng)PCR的靈敏度的100倍。在交互實(shí)驗(yàn)中，對人工污染大腸桿菌和副溶血弧菌的食物樣