快速檢測腸出血性大腸桿菌O157實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的建立.pdf

1、目的:腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157，其典型血清型為O157∶H7，是一種強(qiáng)的致病性細(xì)菌，會導(dǎo)致出血性腹瀉和腸炎，發(fā)病很快，病情嚴(yán)重時可致死。該菌常常污染動物性食品。因此，開發(fā)大腸桿菌O157∶H7新的快速檢測方法，可及時檢出病原菌，避免食物中毒發(fā)生。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，L

2、AMP）在恒溫條件下即可實(shí)現(xiàn)DNA擴(kuò)增，但若精確判定結(jié)果通常需要繁瑣的電泳，且增加了耗時。因此，改進(jìn)LAMP檢測技術(shù)，建立新型的LAMP檢測方法，以省去繁瑣的電泳操作步驟，減少耗時，還可進(jìn)一步提高靈敏度，為大腸桿菌O157∶H7的快速、高靈敏度的檢測探索了新途徑。
　　方法:本研究將LAMP技術(shù)與熒光技術(shù)相結(jié)合，利用實(shí)時熒光監(jiān)測儀，通過電腦軟件對整個LAMP反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌O157∶H7的快速、高靈敏度檢測，并將該

3、技術(shù)稱為實(shí)時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(Real-time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal Amplification Technology, RF-LAMP)。
　　根據(jù)NCBI(Genbank)中公布的大腸桿菌O157∶H7編碼O抗原的rfbE基因保守序列，用Primer Explorer V3 LAMP引物設(shè)計軟件進(jìn)行了大腸桿菌O157∶H7的LAMP引物設(shè)計。對整個RF-LAMP反應(yīng)

4、體系進(jìn)行了優(yōu)化，并對RF-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。研究了RF-LAMP檢測方法的特異性、靈敏度、模板DNA提取方法和人工污染食品（以牛肉為例）的檢出限，并與環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)法進(jìn)行了比較。其研究結(jié)果如下。
　　結(jié)果:經(jīng)優(yōu)化確定了反應(yīng)體系和程序。反應(yīng)體系（共25 μL）:10 μMF3和B3各1μL，10 μM FIP和BIP各3μL，模板DNA 2.5 μL，2.5 mmol/L High Pure dNTPs 4μ

5、L,50 mM MgSO4 1 μL,10×ThermoPolTM Reaction Buffer 4 μL,5M甜菜堿3 μL,8000 U/ml Bst DNA聚合酶大片段1.2 μL，1 μL SYBR Green Ⅰ（1∶300稀釋），其余無菌蒸餾水補(bǔ)足。反應(yīng)程序:溫度為63 ℃，時間為60 min，可根據(jù)實(shí)際反應(yīng)進(jìn)程隨時終止反應(yīng)。
　　利用RF-LAMP技術(shù)檢測大腸桿菌O157∶H7，省去繁瑣的電泳操作步驟，減少耗時，比

6、LAMP檢測O157∶H7的方法更加快捷，最短30 min即可判定結(jié)果。
　　實(shí)時熒光曲線直觀判斷、凝膠電泳分析及熔解曲線的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明RF-LAMP擴(kuò)增反應(yīng)是正確的。
　　在RF-LAMP技術(shù)檢測大腸桿菌O157∶H7的特異性試驗(yàn)中，共有21株試驗(yàn)菌株，其中有兩株為大腸桿菌O157∶H7和另外兩株大腸桿菌O157∶Hund出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，判定為陽性結(jié)果，其他17株非大腸桿菌O157，均沒有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，判定為陰性結(jié)果。<

7、br>　　檢測大腸桿菌O157∶H7純菌的靈敏度為5.1 CFU/mL，其靈敏度是LAMP檢測方法的10倍。
　　分別利用普通熱裂解法、化學(xué)試劑法和試劑盒法比較了人工污染牛肉中大腸桿菌O157∶H7基因組DNA的提取效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明三種方法對擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果影響的差別很小，綜合考慮選擇普通熱裂解法提取人工污染牛肉中大腸桿菌O157∶H7基因組DNA，速度快、成本低。通過實(shí)驗(yàn)測定人工污染牛肉的大腸桿菌O157∶H7檢出限為5.1 CF