環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)豬肉中金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌在空氣、水、土壤及人和動(dòng)物的排泄物中普遍存在，是引起食物中毒的是第二大細(xì)菌，僅次于沙門菌，嚴(yán)重危害人類的健康和安全，因此對(duì)食品進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測(cè)有著重要的意義。目前在食品行業(yè)對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)方法以傳統(tǒng)平板分離培養(yǎng)及鑒定方法為主，但存在操作繁瑣、所需時(shí)間等缺點(diǎn);免疫學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)費(fèi)用較高，操作步驟同樣繁瑣;以PCR技術(shù)為代表的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)雖然靈敏、準(zhǔn)確、快速，但是存在檢測(cè)設(shè)備昂貴，對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)水平要求很高

2、等問(wèn)題，不能再基層地區(qū)普及使用，因此急需開(kāi)發(fā)出一種快速、方便、準(zhǔn)確且廉價(jià)的針對(duì)食品中金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測(cè)的新型技術(shù)。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，即loop-mediated isothermal amplification(LAMP)。是一種新型的體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)，具有以下優(yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、擴(kuò)增效率高及特異性強(qiáng)等，并且檢測(cè)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PCR技術(shù)。目前，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已在病毒檢測(cè)、細(xì)菌檢測(cè)、胚胎檢測(cè)、寄生蟲

3、檢測(cè)等諸多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。
　　本研究以金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)為目標(biāo)基因，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件（https://primerexplorer.jp.lamp3.0.0.index.html）設(shè)計(jì)LAMP對(duì)內(nèi)外引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)鎂離子濃度、dNTP濃度、酶濃度、引物之間的比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定的LAMP反應(yīng)體系為:內(nèi)引物含F(xiàn)IP和BIP各是1.5μL，外引物含F(xiàn)3和B3各是0.5μL，2.

4、5mmol/LdNTP4μL，1.7μ L50mmol/L Mg2+，2.5μ L10×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，1μL8U的Bst DNA聚合酶大片段，2μL DNA模板和用滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系至25μL。LAMP的反應(yīng)過(guò)程為:在62℃水浴鍋中反應(yīng)60分鐘，然后在80℃水浴鍋中水浴10分鐘后停止反應(yīng)。終止反應(yīng)后，判斷LAMP反應(yīng)是否發(fā)生可以通過(guò)肉眼觀察有無(wú)白色焦磷酸鎂沉淀即可，并可通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)是否發(fā)生LAMP反應(yīng)。

5、>　　本實(shí)驗(yàn)對(duì)3株金黃色葡萄球菌和15株其他食源性致病菌進(jìn)行特異性試驗(yàn)，結(jié)果表明，3株金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其他15株菌株為陰性。檢測(cè)結(jié)果表明該LAMP檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法有很高的特異性。
　　用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ploymerase chain reaction，PCR)作為比較對(duì)象，金黃色葡萄球菌的靈敏度可由比較LAMP與PCR方法檢測(cè)得出，PCR的兩條引物由LAMP的兩條外引物F3和B3供給，并對(duì)LAMP人工污染檢

6、出限進(jìn)行測(cè)定，與PCR做對(duì)比，結(jié)果表明，LAMP對(duì)金黃色葡萄球菌檢測(cè)的靈敏度為7.9×101CFU/mL，PCR對(duì)金黃色葡萄球菌檢測(cè)的靈敏度為7.9×103CFU/mL，由此可知，LAMP對(duì)金黃色葡萄球的檢測(cè)在靈敏度方面是PCR的100倍。在耗時(shí)方面，從樣品處理到結(jié)果顯示，LAMP耗時(shí)1小時(shí)， PCR耗時(shí)3小時(shí)，LAMP的檢測(cè)時(shí)間明顯較短。在人工污染食品檢測(cè)方面LAMP的檢出限為7.9×101CFU/mL，PCR的檢出限為7.9×103