dsNKG2D-IL-15殼聚糖納米顆粒的制備及其抗腫瘤活性.pdf

1、DsNKG2D-IL-15為2個NKG2D分子的胞外區(qū)和IL-15的融合蛋白，基于NKG2D分子識別高表達于大部分腫瘤細胞表面的MICA等配體分子，并通過IL-15發(fā)揮激活NK和CD8+T細胞的功能，前期研究已證實，該融合蛋白具有明顯的抗腫瘤效應(yīng)。殼聚糖納米材料是一種新興的藥物載體，在基因疫苗以及各類抗腫瘤藥物的運輸過程中扮演越來越重要的角色。殼聚糖具有生物相容性高，毒性較低，且具有生物可降解性等優(yōu)勢，可作為載體來制備抗腫瘤納米顆粒。本

2、課題擬將前期構(gòu)建的pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組質(zhì)粒、以及自行制備的dsNKG2D-IL-15融合蛋白分別裝載入HTCC(2-羥丙基三甲基氯化銨)殼聚糖納米顆粒中，形成一定大小的納米凝膠顆粒，體內(nèi)外分別評估其激活淋巴細胞的效應(yīng)以及抗腫瘤的效果。
　　研究內(nèi)容分為2個部分:
　　1.裝載pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組基因的納米顆粒的制備及其抗腫瘤活性
　　目的:利用化學修飾過的殼聚糖(

3、HTCC)以及前期工作中構(gòu)建好的重組基因(pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15)來制備抗腫瘤納米顆粒。檢測該納米顆粒的理化性質(zhì)，并觀察其能否將重組基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入細胞，且在細胞內(nèi)表達NKG2D和IL-15的融合蛋白。體外觀察腫瘤細胞受該納米基因顆粒轉(zhuǎn)染后，對NK與CD8+T細胞活性的影響，并且體內(nèi)觀察該納米基因顆粒拮抗B16BL6-MICA黑色素移植瘤體內(nèi)生長的影響。
　　方法:首先將HTCC與重組質(zhì)粒分別按照質(zhì)量比1∶2，2∶

4、1，1∶1混合，震蕩裝載后，離心取上清，用分光光度計檢測其中DNA濃度，按照（DNA總量-游離DNA）/DNA總量的公式來計算包封率。取制備好的納米顆粒，用適量的超純水或PBS緩沖液稀釋后，檢測納米顆粒的粒徑大小及其表面電荷。其次使用MTS/PMS試劑盒檢測納米顆粒對RAW264.7以及B16BL6等細胞的毒性大小。然后，將脂質(zhì)體以及單體蛋白作為對照，使用納米顆粒轉(zhuǎn)染CT-26等細胞，72h后通過FCM檢測NKG2D的表達;使用檢測IL

5、-15的ELISA試劑盒，分析受納米基因顆粒轉(zhuǎn)染后，腫瘤細胞培養(yǎng)上清中IL-15的濃度。并且將轉(zhuǎn)染后的細胞與小鼠脾臟細胞共孵育，次日檢測其NK細胞和CD8+T細胞頻率的改變，以及其活化的情況。最后，給C57BL6小鼠背部皮下接種黑色瘤細胞B16BL6-MICA，成瘤5日后，分別注射PBS，殼聚糖，肌肉注射，瘤內(nèi)注射，持續(xù)三周，每天記錄荷瘤小鼠腫瘤生長情況，以及小鼠的生存狀況。處死小鼠后，通過FCM檢測并分析小鼠脾臟NK細胞和CD8+T細

6、胞的頻率以及CD69、NKG2D和CD44的表達。
　　結(jié)果:該納米材料能夠裝載入pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組基因，并且包封率可達到92.8±0.37％。該納米基因顆粒在較高濃度時，對腫瘤細胞有一定的毒性。該納米顆粒具備轉(zhuǎn)運重組基因dsNKG2D-IL-15至細胞的能力，且FCM以及ELISA檢測證實，腫瘤細胞轉(zhuǎn)染該納米顆粒后，胞漿內(nèi)NKG2D與IL-15均表達。該納米顆粒轉(zhuǎn)染細胞后，可促進NK細胞表達CD69

7、，并上調(diào)CD8+T細胞表面NKG2D和CD44的表達。另外，荷瘤小鼠經(jīng)該納米基因顆粒處理后，明顯抑制移植瘤的生長、且延長小鼠的生存期。
　　結(jié)論:裝載pcDNA3.1-dsNKG2D-IL-15重組基因的納米顆粒可被細胞吞噬并表達dsNKG2D-IL-15融合蛋白。該納米基因顆粒體內(nèi)使用后，可通過激活NK和CD8+T細胞的功能而發(fā)揮抗腫瘤活性。
　　2.裝載dsNKG2D-IL-15重組蛋白的納米顆粒制備及其抗腫瘤活性

8、>　　目的:通過HTCC修飾的殼聚糖以及前期制備的dsNKG2D-IL-15融合蛋白，制備裝載待重組蛋白的納米顆粒。體外檢測該納米顆粒的理化性質(zhì)和細胞毒性，體內(nèi)注射荷瘤小鼠，觀察該納米顆粒的抗腫瘤效果。
　　方法:利用配制好的HTCC殼聚糖，以及課題組前期制備的dsNKG2D-IL-15重組蛋白，制備負載融合蛋白的抗腫瘤納米顆粒。取裝載混合物上清，使用分光光度計檢測游離蛋白濃度，按照下列公式計算包封率:（總蛋白量-游離蛋白量）/總

9、蛋白量×100％。用動態(tài)光散射儀檢測納米顆粒的粒徑，以及納米顆粒表面的Zeta電位。使用MTS/PMS試劑盒檢測該納米顆粒對細胞的毒性作用，并通過透析和蛋白凝膠電泳檢測納米顆粒中蛋白的釋放。最后，給C57BL/6小鼠背部皮下接種B16BL6-MICA黑色素瘤細胞，成瘤5天后，分別給每組小鼠注射生理鹽水(PBS)，殼聚糖(HTCC)溶液，制備好的納米顆粒以及單體重組蛋白。持續(xù)3周，每天記錄小鼠生存狀況，以及腫瘤生長的情況。處死小鼠后，分析

10、荷瘤小鼠脾臟NK和CD8+T細胞頻率的改變和活化狀態(tài)。
　　結(jié)果:HTCC殼聚糖溶液可包裹溶液中的dsNKG2D-IL-15重組蛋白，且質(zhì)量比為1∶1時最高，達到95.3％。粒徑大小在200 nm左右，表面帶5.3 mV正電荷。該納米凝膠對B16BL6等腫瘤細胞有一定毒性，而對小鼠巨噬細胞RAW264.7毒性相對較小。在體外釋放實驗中，能夠在24小時有效釋放重組蛋白。在體內(nèi)實驗中，該納米顆粒治療組與PBS以及殼聚糖對照組相比，在C