抑制Ppif基因的表達(dá)減輕腎缺血再灌注損傷的實驗研究.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定的體外大鼠腎細(xì)胞(NRK cells) 缺血再灌注模型，尋找建立模型的最佳條件，并驗證大鼠Ppif基因在該模型中的表達(dá)；研究siRNA對大鼠Ppif基因的抑制作用；構(gòu)建介導(dǎo)大鼠Ppif基因沉默的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-Ppif,為進(jìn)一步包裝慢病毒載體奠定基礎(chǔ)；觀察抑制大鼠Ppif基因的表達(dá)對缺血再灌注損傷腎臟的保護(hù)作用,并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：（1）體外培養(yǎng)大鼠腎上皮細(xì)胞，以氧糖剝奪(krebs) 液及

2、使用去氧劑連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）來模擬體外大鼠腎細(xì)胞缺血再灌注，Annexin V/PI染色后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）方法檢測Ppif基因 (CypD的編碼基因)的mRNA表達(dá)。（2）根據(jù)大鼠Ppif基因序列設(shè)計并化學(xué)合成3對siRNA及1對陰性對照siRNA,并在5′端標(biāo)記FAM 羧基熒光素,以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染入大鼠腎細(xì)胞,用RT-PCR和Westernblot

3、分別檢測其Ppif基因和蛋白表達(dá)量的改變、驗證所設(shè)計的siRNA的抑制效應(yīng)。（3）以大鼠Ppif基因為靶基因, 根據(jù)RNA 干擾(RNAi) 序列設(shè)計原則, 設(shè)計4對有小發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi靶點序列, 退火形成雙鏈DNA, 雙酶切后定向克隆到慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-Ppif中,構(gòu)建4個含靶基因片段的重組慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-Ppif, 并對質(zhì)粒進(jìn)行PCR及測序鑒定。（4）建立大鼠腎缺血再灌注模型,將實驗動物隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組

4、、缺血再灌注組、治療組(各20只)。治療組大鼠給Ppif基因靶向RNAi慢病毒載體(4 ug/ g) 0.3 mL，缺血再灌注組再灌注時給予0.3 mL 含體積分?jǐn)?shù)0.01DMSO的生理鹽水,假手術(shù)組不夾閉腎蒂,余處理同缺血再灌注組。分別檢測各組血肌酐(Cr) 含量、尿素氮(BUN) 含量、細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)、 HE染色組織病理學(xué)分析。
　　 結(jié)果：（1）去氧去糖40min再復(fù)氧復(fù)糖后，NRK cells 凋亡率于16 h達(dá)到

5、最高值(P＜0.05)。 Ppif mRNA在再復(fù)氧0h時，Ppif mRNA有基礎(chǔ)水平的表達(dá)，4 h開始升高，8 h時表達(dá)水平明顯升高，隨再灌注時間延長，表達(dá)量逐漸增高，再灌注16 h時達(dá)高峰，48 h開始回落，各時段與0h比較，均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；（2）以LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染所設(shè)計的siRNA 進(jìn)入NRK細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率＞90％。起始于405、556位點的siRNA在基因水平對Ppif 無明顯抑制效應(yīng)

6、(P＞0.05);起始于198位點的siRNA在基因和蛋白水平均有明顯的抑制效應(yīng),基因水平下降75.25％（P＜0.05);蛋白水平下降72.13％(P＜0.05)；（3）Ppif的短發(fā)夾RNA（shRNA) 片段被成功克隆到慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pGCL-GFP中, 4個插入序列與設(shè)計的靶基因片段完全一致；（4）治療組與缺血再灌注組比較,血Cr和BUN 均明顯降低, AI 明顯下降, 均有顯著性差異(P＜0.05)，HE染色組織病理學(xué)分析

7、結(jié)果顯著。
　　 結(jié)論：（1）本模型可以模擬體內(nèi)缺血再灌注機(jī)制，去氧去糖40min后再復(fù)氧復(fù)糖16 h是體外NRK cells 缺血再灌注誘導(dǎo)凋亡的最佳條件，并驗證了在缺氧再灌注模型中Ppif基因的表達(dá)。（2）起始于198 位點的siRNA對大鼠腎細(xì)胞的Ppif基因有明顯的抑制效應(yīng)。（3）構(gòu)建了能夠表達(dá)4個含Ppif靶基因片段的慢病毒載體轉(zhuǎn)移質(zhì)粒,為進(jìn)一步包裝介導(dǎo)Ppif基因沉默的慢病毒載體奠定了基礎(chǔ)。（4）Ppif基因靶向RN