灰蓋鬼傘β-1,3-葡聚糖酶的異源重組表達(dá)研究.pdf

1、真菌細(xì)胞壁是位于真菌原生質(zhì)體外的一種剛性結(jié)構(gòu)，對(duì)真菌細(xì)胞進(jìn)行正常的生理活動(dòng)起到重要的保護(hù)作用。在真菌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖的過(guò)程中，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組分會(huì)發(fā)生一定的變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞壁逐漸地?cái)U(kuò)張。對(duì)釀酒酵母和曲霉的研究成果認(rèn)為細(xì)胞壁擴(kuò)張的過(guò)程是在一系列酶的參與下完成的，β-1，3-葡聚糖酶是其中較為重要的酶類，它通過(guò)水解作用使細(xì)胞壁松弛，再以轉(zhuǎn)糖基作用將新合成的葡聚糖鏈加入到原有的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中，使細(xì)胞壁得以擴(kuò)張。為探究在擔(dān)子菌類食用菌中β-

2、1，3-葡聚糖酶對(duì)細(xì)胞壁變化所發(fā)揮的作用，我們以大型傘狀真菌灰蓋鬼傘為研究材料，初步分析了其基因組中的β-1，3-葡聚糖酶基因，并篩選了其中較為重要的基因進(jìn)行重組表達(dá)研究，最終獲得了2個(gè)具有相應(yīng)活性β-1，3-葡聚糖酶，并對(duì)它們的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。以原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌Rosetta(DE3)為宿主細(xì)胞表達(dá)出了外切β-1，3-葡聚糖酶（EXG1）。重組菌在20℃下經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后可大量表達(dá)出目的蛋白，經(jīng)

3、過(guò)超聲破碎和Ni-柱層析后可純化得到EXG1。EXG1分子量大小為85 kDa，酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明該酶最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH環(huán)境為pH6.0，只對(duì)β-1，3-葡聚糖底物有外切活性，未檢測(cè)到轉(zhuǎn)糖基活性。以昆布多糖為底物時(shí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km=2.23 mg ml-1，Vmax=232.56μmolmg-1 min-1。以真核表達(dá)系統(tǒng)畢赤酵母GS115為宿主細(xì)胞表達(dá)出了內(nèi)切β-1，3(4)-葡聚糖酶（eng16A）。重組菌在30

4、℃下以濃度為0.5％的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，可表達(dá)出重組酶并分泌到胞外的培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基用Ni-柱純化后可收獲大量的eng16A蛋白。eng16A分子量大小為60 kDa。對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶最適反應(yīng)溫度為60℃，最適反應(yīng)pH環(huán)境為pH6.0，對(duì)含有β-1，3-糖苷鍵的底物均能表現(xiàn)出水解活性，未檢測(cè)到轉(zhuǎn)糖基活性，在以昆布多糖為底物時(shí)，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km=6.49 mg ml-1，Vmax=57.47μmol mg-1 min-1，在

5、以大麥葡聚糖為底物時(shí)，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km=20.84 mg ml1，Vmax=384.62μmol mg-1min-1。
　　本研究分別以大腸桿菌和畢赤酵母為宿主，對(duì)兩種β-1，3-葡聚糖酶基因進(jìn)行了重組表達(dá)，獲得了具有正確酶活性的日的蛋白，并且用Ni-柱進(jìn)行分離純化得到了大量的純酶。避免了以灰蓋鬼傘子實(shí)體為原始材料進(jìn)行層析色譜法純化過(guò)程中子實(shí)體生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，純化步驟繁瑣且最終收獲的酶量少等一系列問(wèn)題。同時(shí)，我們對(duì)這兩種β-1，3-