Wnt-β-catenin信號通路在肺纖維化形成中的機制研究.pdf

1、目的:特發(fā)性肺纖維化為致命的肺部疾病。其特點是肺上皮細胞損傷，肺成纖維細胞/肌成纖維細胞增殖和細胞外基質(zhì)過渡沉積，造成肺結(jié)構(gòu)破壞。但機制不明。最近的證據(jù)表明，Wnt信號通路在IPF患者異?；钴S。本研究采用Wnt1蛋白干預人胚肺成纖維細胞，探討對細胞增殖、活化的影響;通過Wnt1蛋白及β-catenin質(zhì)粒干預A549細胞，探討Wnt/β-catenin信號通路對肺上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)變作用。通過模型鼠，觀察肺纖維化形成過程中，β-caten

2、in動態(tài)變化規(guī)律。用肺纖維化模型鼠的支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)HEPF和A549細胞，探討對細胞表型轉(zhuǎn)變的影響，及與Wnt/β-catenin信號通路的相關(guān)性;用β-catenin基因siRNA干擾慢病毒沉默β-catenin，再用支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)細胞，對細胞表型轉(zhuǎn)變的影響，進一步揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路對成纖維細胞活化、增殖及肺上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)變的作用。
　　方法:我們用不同濃度的Wnt1干預人胚肺成纖維細胞，MTT

3、檢測細胞增殖率，RT-PCR及westenblot檢測α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達;不同濃度的Wnt1干預A549細胞，RT-PCR及westenblot檢測E-鈣粘蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達;然后用β-catenin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞，光鏡下觀察細胞形態(tài)變化，RT-PCR及westenblot檢測E-鈣粘蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達。進一步我們用氣管內(nèi)滴入博萊霉素構(gòu)

4、建小鼠肺纖維化模型，于造模后的第3、7、14、28天，取肺組織蘇木精-伊紅及Masson染色觀察肺組織炎癥及纖維化程度，堿水解法檢測肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量，免疫組織化學法及westenblot檢測β-catenin蛋白的表達。用造模后第7天獲取支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞和A549細胞，RT-PCR及westenblot檢測E-鈣粘蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白及β-cateninmRNA及蛋白表達。進一步構(gòu)建β

5、-catenin基因RNA干擾慢病毒表達載體，篩選出高效特異性抑制β-atenin基因的shRNA慢病毒載體。將β-cateninsiRNA慢病毒轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細胞和A549細胞，再用肺纖維化模型鼠支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)細胞，RT-PCR及westenblot檢測E-鈣粘蛋白、α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達。
　　結(jié)果:不同濃度Wnt1干預人胚肺成纖維細胞，促進細胞增值，尤其當濃度大于20μg/l，細

6、胞增殖更明顯，并且α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達增加，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。Wnt1干預A549細胞E-鈣粘蛋白mRNA及蛋白表達減少，而α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達增加，尤其當Wnt1濃度大于20μg/l時，變化更明顯。β-catenin質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細胞，細胞形態(tài)發(fā)生改變，由原來的鵝卵石狀變成了梭型，同時E-鈣粘蛋白mRNA及蛋白表達減少，而α-平滑肌肌動蛋白

7、、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA及蛋白表達增加。我們用博萊霉素氣管內(nèi)滴入，構(gòu)建小鼠肺纖維化模型，與對照組比較，在纖維化形成過程中，肺組織中β-catenin蛋白表達第7天升高，表達高峰在第14天，第28天下降，但仍高于第7天。為了探討肺泡上皮細胞損傷后誘導肺組織異常修復，在肺組織纖維化形成中與Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)系，我們用肺纖維化模型鼠第7天支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)人胚肺成纖維細胞，α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋

8、白mRNA和蛋白的表達均顯著增加，而且與β-catenin相關(guān)。轉(zhuǎn)染慢病毒β-cateninsiRNA的人胚肺成纖維細胞后，再用肺纖維化模型鼠支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)細胞，α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白mRNA和蛋白沒有顯著增加。我們又用小鼠肺纖維化模型第7天支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)A549細胞，結(jié)果顯示表達間質(zhì)特異性標記物α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白升高，而上皮標記物E-鈣粘蛋白減低，與β-catenin升高有關(guān)。當

9、我們預先用β-cateninsiRNA慢病毒轉(zhuǎn)染A549細胞，再用肺纖維化模型鼠的支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)A549細胞，結(jié)果顯示α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、Ⅰ型膠原蛋白升高不明顯，E-鈣粘蛋白也無明顯下降。
　　結(jié)論:我們的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路可以促進人胚肺成纖維細胞增殖并誘導向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變，促進細胞外基質(zhì)沉積;Wnt/β-catenin信號通路可誘導肺上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)變，從而增加成纖維細胞/肌纖維細胞的數(shù)