2型糖尿病高糖、高胰島素對人和小鼠胰腺星狀細胞功能和增殖的影響.pdf

1、流行病學(xué)研究提示:肥胖、糖尿病與胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PDAC)的發(fā)生存在緊密聯(lián)系。一項Meta分析顯示，按2型糖尿病(type2diabetes mellitus，T2DM)患者不同病程1年、1-4年、5-9年、10年以上分析，患PDAC的相對危險度(relative risk，RR)分別為5.38、1.95、1.49、1.47。T2DM是一組由胰島素抵抗引起胰島β細胞過度分泌胰島素導(dǎo)致的以高血糖

2、和高胰島素血癥為主要特征的臨床癥候群。T2DM導(dǎo)致PDAC的機制尚不完全清楚，目前針對胰島素在PDAC發(fā)生發(fā)展中作用的研究主要集中在其對腫瘤細胞的增殖及存活效率方面的影響，而對胰腺基質(zhì)細胞的影響關(guān)注甚少。胰腺纖維化是PDAC的病理特征之一，其中負責產(chǎn)生大量纖維基質(zhì)反應(yīng)的是活化的胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cell，PaSC)。我們的前期研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)的Kras基因突變的PDAC小鼠模型體內(nèi)可見血糖和胰島

3、素水平明顯增高以及胰腺組織中大量活化的PaSC。本研究主要探討高濃度的胰島素和葡萄糖對人和小鼠PaSC活化、增殖和促纖維化反應(yīng)方面的影響及其相關(guān)信號傳導(dǎo)通路。
　　第一部分、2型糖尿病患者及高脂喂養(yǎng)小鼠胰腺中存在活化的胰腺星狀細胞及大量膠原蛋白沉積
　　目的:明確T2DM患者及高脂喂養(yǎng)小鼠胰腺纖維化的程度以及PaSC的分布及活化情況。
　　方法:(1)收集非糖尿病和T2DM患者捐贈的胰腺組織各3例（女性，年齡范圍:52

4、-57歲），經(jīng)4％多聚甲醛固定，石蠟包埋(formalin-fixed，paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)后行4μm連續(xù)切片。石蠟切片行馬松染色(Masson'sstaining)和免疫熒光雙標染色(PaSC marker/α-SMA，pancreaticβ cellmarker/insulin)，觀察T2DM患者胰腺組織中膠原蛋白(Collagen，Col)沉積以及PaSC的分布，評估T2DM患者胰腺纖維化和PaSC活化情

5、況。(2)選取6周齡雌性C57BL/6小鼠共40只，隨機分為兩組:普通飼料(control diet，CD)飼養(yǎng)的對照組和高脂、高熱量飼料(high fat，high calorie，HFCD)飼養(yǎng)的實驗組，每組各20只，再分為四亞組，每亞組各5只，分別飼養(yǎng)3、6、9和12月后取各組小鼠的胰腺組織制備4μm的石蠟切片，行天狼星紅(sirius red)染色及免疫熒光雙標染色(PaSC marker/α-SMA，pancreaticβ c

6、ell marker/insulin)，評估HFCD喂養(yǎng)小鼠胰腺纖維化的程度以及PaSC活化情況。
　　結(jié)果:(1) Masson's染色結(jié)果顯示:非糖尿病患者的胰腺形態(tài)正常，膠原纖維主要局限分布在血管周圍。與非糖尿病患者相比，T2DM患者胰腺中可見大量藍色膠原纖維，且不僅在血管周圍，在胰島內(nèi)以及胰島周圍均可見大量膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ，ColⅠ)沉積，T2DM患者胰腺組織膠原蛋白沉積的量約是非糖尿病患者的3倍;免疫熒光染

7、色結(jié)果顯示:非糖尿病患者胰腺中PaSC活化標志物α-SMA+細胞較少，且主要局限在血管周圍，但T2DM患者胰腺中α-SMA+細胞較對照組明顯增加，且主要分布在insulin+的胰島β細胞周圍。(2) Sirius red染色結(jié)果顯示:HFCD喂養(yǎng)12月的小鼠胰腺出現(xiàn)輕微的纖維化和胰島細胞肥大，與對照組小鼠胰腺組織中膠原蛋白多沉積于血管周圍不同，HFCD組小鼠胰島及鄰近腺泡細胞周圍均可見大量ColⅠ沉積。且胰腺組織ColⅠ沉積量也隨HFC

8、D喂養(yǎng)時間的增長而明顯增加。同期的免疫熒光染色也得到了與Sirius red一致的結(jié)果，HFCD喂養(yǎng)小鼠的胰島內(nèi)存在大量α-SMA+的活化PaSC。
　　結(jié)論:本課題首次在T2DM患者和HFCD肥胖小鼠模型的胰腺中發(fā)現(xiàn)活化的PaSC，為“T2DM和肥胖為PaSC活化和纖維基質(zhì)反應(yīng)提供微環(huán)境”的假說提供了新證據(jù)，也為后續(xù)進一步研究高糖、高胰島素的T2DM環(huán)境對PaSC活化、增殖和功能等生物學(xué)特性的影響及其相關(guān)信號通路提供了依據(jù)。

9、r>　　第二部分、人和小鼠胰腺星狀細胞的分離鑒定以及高糖、高胰島素對胰腺星狀細胞活化、增殖和功能的影響
　　目的：分離、培養(yǎng)并鑒定小鼠原代PaSC。觀察PaSC卜胰島素受體的表達情況。觀察高濃度胰島素與高糖對PaSC活化、增殖及細胞外基質(zhì)(extracellubr matrix，ECM)合成等生物學(xué)特性的影響及其相關(guān)信弓傳導(dǎo)通路。
　　方法：(1)取人及小鼠新鮮胰腺組織用于PaSC細胞的分離。對傳代培養(yǎng)的第二代PaSC行免疫

10、熒光染色，鑒定PaSC特征性標志物(α-SMA，Desmin，Vimentin)，ECM蛋白成分[collagenⅠ，collagen Ⅲ，纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)]。(2)用新鮮分離的小鼠原代胰腺星狀細胞(mouse primarypancreatic stellate cell，mPaSC)行蛋白印跡試驗(western blot，WB)及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time P

11、CR，qPCR)檢測明確PaSC上胰島素受體(insulin receptog IR)和胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growthf actorr eceptor，IGF-1R)的表達。(3)qPCR檢測高濃度胰島素在高糖環(huán)境下對PaSC活化的影響。(4)WB檢測高濃度胰島素單獨或聯(lián)合高糖對PaSC上IR／IGF-1R的激活以及下游信號分子(AKT，mTOR，P70S6K，ERK，JNK)的活性。(5)qPCR和M

12、TT法分別檢測高濃度胰島素單獨或與高糖聯(lián)合作用對己活化PaSC增殖及ECM蛋向合成的影響。
　　結(jié)果：(1)免疫熒光染色鑒定分離得到的PaSC，傳代后胞內(nèi)脂質(zhì)消失，表達星狀細胞標記物0c-SMA，Nestin，Vimentin，并高表達ECM(collagen I，collagen Ⅲ，fibronectin)。(2)蛋白印跡實驗及qPCR結(jié)果均證實PaSC同時高表達IR(主要表達IR-A亞型)和IGF-1R受體，且IR和IG-1

13、R的表達量在PaSC靜息和活化狀態(tài)下無明顯差異。以不同胰島素濃度(25～100nM)刺激PaSC，24h可見IR和IGF-1R水平均隨胰島素濃度梯度升高而明顯下調(diào)，48h恢復(fù)至對照組水平。(3)qPCR結(jié)果顯示：與10％FBS的陽性對照相比，高糖、高胰島素作用下的PaSC并未出現(xiàn)細胞數(shù)量和α-SMA+細胞的增多，提示高濃度胰島素對PaSC活化無明顯影響。但在高胰島素的刺激下，己活化的PaSC合成Col和FN等ECM蛋白的能力明顯高于對照

14、組[Col：(1.61±0.12) vs.(1.000±0.03)，P＜0.05；FN：(1.72±O.04) vs.(1.000±0.06)，P＜O.05]。(4)WB表明，不同濃度梯度的胰島素可誘導(dǎo)PaSC表面IR/IGF-1R的磷酸化，且100nM的胰島素誘導(dǎo)的IR/IGF-1R磷酸化水平最強，為對照組的7.4倍(p＜O.05)。IR/IGF-1R的磷酸化還可導(dǎo)致下游MAPK／ERK和AKT/mTOR信號通路的激活。與ERK1/2

15、和SAPK/JNK在高濃度胰島素處理后出現(xiàn)的快速而短暫的磷酸化水平增加相比，AKT/mTOR路的激活強效而持久。此外，胰島素單獨或與高糖聯(lián)合作用于PaSC1、3、6和24h，均可引起IR/IGF-1R，AKT，P70S6K，ERK1/2不同程度的蛋白磷酸化水平升高，且與高糖聯(lián)合作用下，上述蛋白的磷酸化水平升高更為明顯。(5)已活化的PaSC受高糖、高胰島素單獨或聯(lián)合作用刺激48h，qPCR結(jié)果顯示：與對照組相比，高糖、高胰島素均可一定程

16、度地提高PaSC合成ECM蛋白的能力，F(xiàn)N和ColⅠ的mRNA水平較對照組明顯升高，且高糖，高胰島素聯(lián)合作用的增強效果更明顯[FN：(1.85±0.10) w.(1.000±O.13)，P＜0.05；Col：(1.74±0.08) vs.(1.000±0.07)，P＜0.05]。但無論是高糖亦或是高胰島素對α-SMA的mRNA水平均無明顯影響。MTT結(jié)果顯示：高糖、高胰島素單獨刺激72h，PaSC細胞增殖的數(shù)量是對照組的1.8倍(p＜0

17、.05)，而兩者聯(lián)合作用下的細胞增殖量是對照組的2.7倍(p＜O.05)。
　　結(jié)論：PaSC高表達IR和IGF-1R受體，且兩者的表達量在PaSC靜息和活化狀態(tài)下無明顯差異。高濃度的胰島素可與IR/IGF-1R結(jié)合，使受體磷酸化，并激活下游AKT/mTOR和MAPK/ERK兩條重要信號通路，促進已活化PaSC細胞的增殖和合成ECM蛋白的能力，但無論是高濃度的胰島素還是高糖對PaSC的活化無明顯影響。
　　第三部分、mTOR

18、通路阻斷劑(KU63794)對胰島素誘導(dǎo)的胰腺星狀細胞功能和增殖的影響
　　目的：在第二部分實驗中，我們已觀察到胰島素能夠誘導(dǎo)PaSC表面IR/IGF-1R受體磷酸化以及AKT/mTOR和MAPK/ERK重要信號通路的激活。且胰島素對AKT/mTOR信號通路的激活比MAPK／ERK更為持久和顯著，為了進一步闡述AKT/mTOR信號通路在胰島素誘導(dǎo)的PaSC增殖和促纖維化反應(yīng)中的作用，我們選擇roTOR復(fù)合物1(mTORcomple

19、x 1，mTORCl)和mTOR復(fù)合物2(mTOR complex 2，mTORC2)的小分子選擇性阻斷劑KU63794(KU)，觀察其對AKT/mTOR信號通路以及PaSC增殖與合成ECM相關(guān)蛋白的影響，并分析相關(guān)的分子機制。
　　方法：小鼠胰腺星狀細胞細胞系(immortalizedm ouse PaSC，imPaSC)分別用mTOR阻斷劑KU(1μM)或新鮮的無血清培養(yǎng)基預(yù)處理1h，(1)用胰島素(100nM)干預(yù)15min

20、-48h，通過WB分析KU對imPaSC下游信號通路活性的影響。(2)用胰島素(100nM)干預(yù)48h，通過WB檢測KU對imPaSC合成ECM蛋白能力的影響。(3)用胰島素(100nM)干預(yù)48h或96h，通過MTT法檢測KU對imPaSC增殖能力的影響。
　　結(jié)果：(1)WB結(jié)果表明，以1μM KU阻斷mTOR通路，能夠完全抑制imPaSC由胰島素誘導(dǎo)的P70S6K蛋白在Thr389位點的磷酸化，且這種抑制作用可持續(xù)至少48h

21、，同時能顯著降低AKT在Ser473的磷酸化水平。但p-ERK1/2與對照組相比無明顯變化。(2)WB結(jié)果顯示，與對照組相比，KU(1μM)預(yù)處理imPaSC，能夠幾乎完全抑制胰島素誘導(dǎo)的FN，ColⅠ以及4-羥化酶α2(the alpha subunit 2 of prolyl 4-hydroxylase，P4HA2)蛋白水平的增加(p＜0.05)。與此相反的是，無論是高濃度的胰島素(100nM)還是KU(1μM)對PaSC活化標志物