沙門氏菌耐藥質(zhì)粒的篩查與特征分析.pdf

1、沙門氏菌是一種重要的食源性致病菌，分布十分廣泛，嚴(yán)重威脅大眾健康與安全。由于抗生素的長(zhǎng)期大量使用以及很多情況下的濫用，導(dǎo)致沙門氏菌的耐藥性問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，新的耐藥菌株不斷出現(xiàn)。質(zhì)粒作為一種自主復(fù)制的可移動(dòng)元件，廣泛存在于沙門氏菌中，并參與其耐藥性的水平轉(zhuǎn)移。因此，了解沙門氏菌質(zhì)粒類型分布，并探究質(zhì)粒與耐藥性之間的關(guān)系，對(duì)耐藥沙門氏菌的預(yù)防與防治具有重大意義。
　　本研究的主要內(nèi)容如下：
　　一、不同來(lái)源沙門氏菌血清分型

2、>　　根據(jù)O抗原（rfb基因簇）、H1抗原（fliC基因）和H2抗原（fljB基因）分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，并與測(cè)序相結(jié)合，對(duì)78株沙門氏菌進(jìn)行血清型測(cè)定，并用傳統(tǒng)玻片凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證工作。結(jié)果表明 PCR方法與測(cè)序相結(jié)合鑒定沙門氏菌血清型的準(zhǔn)確度達(dá)98.7％（77/78），僅1株傷寒沙門氏菌的H2抗原出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，且編號(hào)為SJTUF10023的自凝菌被鑒定為鼠傷寒沙門氏菌。血清分型結(jié)果共獲得以鼠傷寒（25/78，32.1%）和腸

3、炎沙門氏菌（12/78，15.4%）為主的21種血清型。
　　二、不同來(lái)源沙門氏菌MLST分型與耐藥基因分布
　　本研究共獲得24個(gè)ST型，其中ST34為優(yōu)勢(shì)序列型，占所有菌株的23.1%（18/78）。利用 MLST可以精確的預(yù)測(cè)區(qū)分不同血清型菌株，聚類的各個(gè)分支與血清型基本呈對(duì)應(yīng)關(guān)系（75/78，96.2%），其中有3株沙門氏菌（1株阿貢納、1株阿伯丁和1株斯坦利）的聚類結(jié)果與血清型不一致。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期工作獲得的耐藥表

4、型和耐藥基因，結(jié)合MLST分型結(jié)果顯示：超過(guò)一半的blaOXA-1基因分布于ST34菌株中（18/25，72.0%），ST34型沙門氏菌對(duì)應(yīng)的血清型為鼠傷寒沙門氏菌，表明鼠傷寒沙門氏菌耐藥情況較為嚴(yán)重；78株沙門氏菌耐藥表型及耐藥基因分布較為分散，MLST分型結(jié)果與沙門氏菌耐藥表型及耐藥基因之間無(wú)明顯相關(guān)性。
　　三、不同來(lái)源沙門氏菌的質(zhì)粒分型
　　利用5組多重PCR和3組單重PCR，共18對(duì)引物，對(duì)78株菌攜帶的質(zhì)粒不相容

5、群（Inc）進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)78株沙門氏菌中有74株沙門氏菌攜帶常見(jiàn)的質(zhì)粒不相容組群，所攜帶的質(zhì)粒類型包括9種不相容組群（Inc P、Inc HI2、Inc N、Inc A/C、Inc FIIS、Inc FIA、Inc FIB、Inc FIC、Inc I1），其中Inc P群（45/78，57.7%）和Inc HI2群（32/78，41.0%）兩種不相容群質(zhì)粒分布最多。與MLST分型結(jié)果對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，ST34菌株均攜帶Inc HI2質(zhì)粒，

6、不攜帶Inc F質(zhì)粒（包括Inc FIIS、Inc FIC、Inc FIA、Inc FIB），ST11菌株均不攜帶Inc HI2質(zhì)粒。
　　將耐藥基因與所攜帶質(zhì)粒類型比較發(fā)現(xiàn)，攜帶blaCMY-2耐藥基因的菌株均攜帶有Inc I1和Inc HI2質(zhì)粒；攜帶有qnrA耐藥基因的菌株基本上均攜帶有Inc A/C質(zhì)粒（4/5，80.0%）；攜帶blaOXA-1耐藥基因的菌株中88.0%攜帶Inc HI2質(zhì)粒（22/25），12.0%攜帶

7、Inc P質(zhì)粒（3/25），12.0%攜帶Inc I1質(zhì)粒（3/25）；攜帶blaTEM-1耐藥基因的菌株攜帶的質(zhì)粒類型復(fù)雜，包括Inc HI2、Inc P、Inc I1和Inc A/C質(zhì)粒。
　　將32株具有耐藥表型沙門氏菌攜帶的質(zhì)粒不相容群與耐藥表型相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)共攜帶5種質(zhì)粒家族的質(zhì)粒（Inc HI2、Inc P、Inc F、Inc I1和Inc A/C），其中Inc HI2質(zhì)粒最為普遍（19/32，59.4%），另外所有攜帶

8、Inc N質(zhì)粒的菌株均沒(méi)有耐藥表型（20/20，100%），絕大部分?jǐn)y帶Inc P質(zhì)粒的菌株沒(méi)有耐藥表型（39/45，86.7%）。
　　四、耐藥沙門氏菌質(zhì)粒消除與耐藥基因定位
　　按照5% SDS+LB液體培養(yǎng)基44.5℃培養(yǎng)48 h的方法，對(duì)32株耐藥沙門氏菌進(jìn)行質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)，共得到15株耐藥表型丟失菌株，消除效率為46.9%。提取15株耐藥丟失菌株的質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，消除實(shí)驗(yàn)前后質(zhì)粒譜型發(fā)生明顯變化。Inc HI2、Inc I

9、1和Inc F都有不同程度的丟失（消除率分別為87.5%、100%、100%），相對(duì)的耐藥基因acc(6’)-ib-cr、blaOXA-1、blaTEM-1、blaCMY-2、qnrA也有一定程度的丟失（消除率分別為42.9%、80.0%、83.3%、100%、100%）。
　　通過(guò)對(duì)消除實(shí)驗(yàn)前后，沙門氏菌耐藥表型、耐藥基因及質(zhì)粒不相容群的分析比較，發(fā)現(xiàn)丟失的質(zhì)粒主要為Inc HI2質(zhì)粒，β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因（blaOXA-1、

10、blaTEM-1和blaCMY-2）隨著Inc HI2質(zhì)粒的丟失而丟失，相應(yīng)的耐藥表型也隨之丟失；攜帶Inc I1質(zhì)粒菌株的β-內(nèi)酰胺酶類耐藥基因隨著Inc I1的丟失而丟失；攜帶Inc F家族質(zhì)粒的菌株的耐藥基因隨著質(zhì)粒消除而丟失。5株攜帶Inc P質(zhì)粒的菌株中，Inc P質(zhì)粒沒(méi)有被消除，但耐藥基因和耐藥表型都有一定程度的丟失，推測(cè)本研究中沙門氏菌耐藥性的水平轉(zhuǎn)移主要與Inc HI2質(zhì)粒有關(guān)，與Inc P質(zhì)粒無(wú)關(guān)。
　　本文對(duì)7