RGD介導(dǎo)多西他賽pH敏感脂質(zhì)體的合成、制備、表征及體內(nèi)外抗腫瘤活性評價.pdf

1、多西他賽(Docetaxel，DTX)，半合成紫杉醇類似物，是臨床上廣泛應(yīng)用于乳腺癌、胰腺癌、晚期卵巢癌、、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤治療的一線藥物;通過加強微管蛋白聚集，使得細(xì)胞有絲分裂停留于G2/M期而凋亡;多西他賽，脂溶性大于水溶性，水中溶解量較低、體內(nèi)非特異性分布等特點，臨床應(yīng)用中出現(xiàn)生物利用度比較低現(xiàn)象，明顯削弱藥物的臨床抗腫瘤作用。臨床中采用制劑為“多帕菲(R)”和“泰索帝(R)”注射液，處方中均含有大量Tween-80和乙醇用

2、以增溶，其中輔料Tween-80易引起超敏反應(yīng)、神經(jīng)毒性、腎毒性等嚴(yán)重副反應(yīng)。因此，設(shè)計和制備高靶向性新型藥物傳輸體系，是目前亟待攻克的難題。
　　脂質(zhì)體具有良好相容性、緩控釋及靶向性、長循環(huán)等優(yōu)點，是最具潛力的新型藥物、蛋白、基因等的遞送系統(tǒng)之一;脂質(zhì)體制備過程中加入pH敏感材料亞油酸(LA)，進(jìn)入腫瘤酸性微環(huán)境后，脂質(zhì)雙層膜不穩(wěn)定破裂，迅速釋放內(nèi)容物;精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列簡寫RGD，與整合素有較強特異性親和力，尤其

3、是αvβ3，近幾年作為一種靶向因子得到廣泛關(guān)注。本文首次合成RGD-PEG-LA，通過PEG鏈段的“架橋作用”將靶向因子RGD修飾在制劑表面;成功制備RGD介導(dǎo)的載多西他賽pH敏感脂質(zhì)體(RGD/DTX-PSL)，并考察其藥劑學(xué)和生物學(xué)特性，研討其抗腫瘤治療的應(yīng)用前景。本文主要研究內(nèi)容如下:
　　1、DTX-PSL的制備及理化性質(zhì)考察
　　本部分建立了HPLC法精確測定DTX體外含量。采用經(jīng)典薄膜分散法制備，磷脂酰乙醇胺(P

4、E)、膽固醇(CHOL)為主體組成物質(zhì)，LA為pH敏感物質(zhì)，包載模型藥物DTX;主要考察制劑包封率高低，通過單因素實驗和正交優(yōu)化實驗，獲得DTX-PSL的最適宜處方組成和成熟制備工藝。同時對DTX-PSL制劑理化性質(zhì)進(jìn)行考察，包括平均粒徑和粒徑分布、Zeta電勢、透射電鏡(TEM)、載藥量（DL％）和包封率（EE％）等指標(biāo)的測定。
　　測得DTX-PSL制劑的DL％為4.8±0.1％，EE％為81.9±2.2％;動態(tài)光散射法測得平

5、均粒徑及粒徑分布為127.2±3.58 nm，PDI為0.218±0.15，Zeta電勢為-35.19±1.27mV;TEM照片可觀察制劑外觀:圓形或類圓形，均一，表面完整光滑。
　　2、RGD-PEG-LA分子的合成及RGD/DTX-PSL的制備
　　采用固相合成法(FMOC-SPSS)，按次序加入芴甲氧羰基N端占位修飾的分子，最終制備得到RGD-PEG-LA分子，并通過電噴霧質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜對結(jié)構(gòu)進(jìn)

6、行鑒定;DTX-PSL最優(yōu)處方中加入適量RGD-PEG-LA分子，薄膜分散法制得RGD/DTX-PSL，同樣方法考察制劑平均粒徑、Zeta電勢、透射電鏡照片，并表征DL％和EE％等;采用透析袋法，以多帕菲(R)為對照組，分別考察DTX-PSL和RGD/DTX-PSL在pH5.0、pH7.4含0.5％ Tween-80磷酸鹽釋放介質(zhì)中的釋放行為。
　　ESI-MS中最高峰M=347.1是RGD分子離子峰，說明RGD合成正確無誤;分析

7、RGD-PEG-NH2和RGD-PEG-LA分子MALDI-TOF-MS圖譜，顯示在理論分子量2383Da和2645Da處峰位較高，說明已獲得目標(biāo)分子RGD-PEG-LA。
　　測得RGD/DTX-PSL制劑的DL％為4.3±0.2％，EE％為78.4±1.7％;動態(tài)光散射法測得平均粒徑及粒徑分布為146.4±4.38 nm，PDI為0.169±0.13，Zeta電勢為-31.82±0.92mV;透射電鏡照片中制劑成型完整，均勻如

8、一。
　　體外釋放結(jié)果可知，與多帕菲(R)對照組相比，DTX-PSL和RGD/DTX-PSL制劑釋放時間明顯延長，具有較好緩釋性;另外，DTX-PSL和RGD/DTX-PSL在pH5.0釋放介質(zhì)中較pH7.4介質(zhì)釋放速度快，且有明顯突釋現(xiàn)象，顯示制劑具有一定pH敏感性;DTX-PSL和RGD/DTX-PSL制劑在不同pH環(huán)境中釋放趨勢相同，可知RGD靶向因子的存在并沒改變脂質(zhì)體的體外釋放特性。
　　3、DTX-PSL和RGD

9、/DTX-PSL的體內(nèi)、外抗腫瘤實驗
　　采用MTT法研究Duopafei(R)、DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制劑對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的毒性作用;載香豆素-6脂質(zhì)體(C6-PSL和RGD/C6-PSL)與MCF-7孵育后，倒置熒光顯微鏡定性查看熒光強度并拍照，流式細(xì)胞儀定量測定熒光攝取情況。荷瘤Balb/c-Nu尾靜脈注射NBD-PSL、RGD/NBD-PSL制劑，共聚焦顯微鏡觀察腫瘤切片中熒光強度;抑瘤率實驗中測定

10、鼠體重、腫瘤體積、剝離瘤塊重量，考察制劑體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　MTT實驗中Duopafei(R)、DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制劑與MCF-7作用不同時間，能殺死一半細(xì)胞的藥物濃度（IC50）分別為24 h:6.81±0.53、4.43±0.15、2.44±0.49，48h:5.06±0.33、2.47±0.20、1.28±0.23,72 h:1.84±0.10、1.50±0.13、1.05±0.04。細(xì)胞攝取和腫瘤切片

11、實驗顯示:兩制劑組熒光強度遠(yuǎn)高于游離熒光材料組，且RGD/DTX-PSL組熒光強度高于未修飾脂質(zhì)體組。抑瘤率實驗中瘤體積大小為:生理鹽水組＞Duopafei@＞DTX-PSL＞RGD/DTX-PSL。以上結(jié)果，說明本實驗制備的靶向脂質(zhì)體體內(nèi)、外抗腫瘤效果良好。
　　4、DTX-PSL和RGD/DTX-PSL大鼠體內(nèi)藥動學(xué)研究
　　本實驗以SD大鼠為實驗動物，分別尾靜脈注射Duopafei(R)、DTX-PSL、RGD/DTX

12、-PSL制劑，按預(yù)設(shè)時間點頸靜脈竇取血，液液萃取法處理血樣，加入紫杉醇作為內(nèi)標(biāo)物，HPLC法測定血液中藥物濃度，并利用DAS2.0處理得統(tǒng)計矩參數(shù)。DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制劑AUC0-∞(25.363，38.081)值均大于Duopafei(R)組AUC0-∞值(10.703)，而CLz值(0.513，0.341)遠(yuǎn)小于Duopafei(R)組CLz(1.215)，說明在相同時間點DTX-PSL、RGD/DTX-PSL組

13、大鼠體內(nèi)藥濃度均高于Duopafei(R)組。另外，DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制劑t1/2z(2.455，3.478)分別為Duopafei(R)組t1/2z(1.187)的2倍、3倍，可知DTX-PSL、RGD/DTX-PSL制劑能夠明顯延長藥物在血液中的存留時間。
　　綜上所述，本文通過合成RGD-PEG-LA分子，將RGD分子修飾于pH敏感脂質(zhì)體表面，制備工藝簡單，粒徑均勻，外觀良好，極大提高多西他賽溶解度;通過