豬流感病毒和“豬-禽”流感重配病毒的拯救及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、豬流感(Swine Influenza，SI)是由豬流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)引起豬的一種急性、高度接觸性的呼吸道傳染病。SIV不僅可感染豬，同時(shí)也具有感染禽等鳥類和人、馬等其他哺乳動(dòng)物的能力。而豬可被禽流感病毒(Avian InfluenzaVirus，AIV)和人流感病毒感染，是流感病毒基因重組或重配的“混合器”和流感病毒新流行毒株產(chǎn)生的“孵育器”，因而豬是流感病毒“禽-哺乳動(dòng)物”種間傳播鏈中重要

2、的中間宿主。SIV及豬的這些特征決定了它們?cè)诹鞲胁《痉N間傳播中具有不可替代的地位，SIV在流感病毒的流行、跨種傳播等方面的研究以及在公共衛(wèi)生上都具有重要意義。本研究利用流感病毒8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)成功拯救了一株豬流感病毒以及兩株“豬-禽”流感重配病毒，并比較兩株重配病毒與其親本毒之間的毒力差異。這為研究評(píng)估“豬-禽”流感重配病毒的風(fēng)險(xiǎn)以及流感病毒跨種傳播提供了一定依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.HIN1亞型豬流感病毒的拯救。

3、>　　 利用流感病毒8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)成功拯救出了豬流感病毒毒株A/Swine/TianJin/01/2004(H1N1)(A/S/TJ/04)。將豬流感病毒8個(gè)基因節(jié)段經(jīng)RT-PCR合成cDNA后，分別克隆到RNA聚合酶Ⅰ/Ⅱ雙向表達(dá)載體pHW2000中，構(gòu)建成8個(gè)重組質(zhì)粒。用8個(gè)重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，30小時(shí)后加入TPCK-胰酶至終濃度0.5μg/mL。共轉(zhuǎn)染48～72 h后收獲COS-1細(xì)胞及其上清，經(jīng)尿囊腔接種9日齡SPF

4、雞胚。收獲死亡雞胚尿囊液并繼續(xù)用SPF雞胚傳3代，得到有感染性的病毒。經(jīng)血凝、血凝抑制試驗(yàn)、測(cè)序分析、電鏡觀察等均證實(shí)了A/S/TJ/04豬流感病毒的成功拯救，這為進(jìn)一步研究豬流感病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、流感跨種傳播的機(jī)制以及構(gòu)建新型豬流感疫苗株奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.“豬-禽”流感重配病毒的拯救及其生物學(xué)特性的研究。
　　 以流感病毒8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)為工具，分別將豬流感病毒毒株A/S/TJ/04的HA基因以及HA和N

5、A基因用禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)(A/C/HB/04)的相應(yīng)基因片段進(jìn)行置換，構(gòu)建了“7+1”型重配病毒T+H(HA)和“6+2”型重配病毒T+H(HA/NA)，并測(cè)定親本毒和重配毒的EID50。以BALB/c小鼠為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，各種病毒以106EID50的病毒量對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，觀察小鼠的存活率和體重變化情況，并在攻讀后第3、6、12天取小鼠心、肺、脾、直腸和腦，計(jì)算組織體重比(即比重)，利

6、用抗原捕捉ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)各器官的病毒含量。通過對(duì)各攻毒組的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，比較親本毒株和重配毒株對(duì)小鼠感染致病能力的差異。結(jié)果顯示，重配毒株對(duì)小鼠的致病力介于兩親本毒之間，強(qiáng)于豬流感病毒.A/S/TJ/04而弱于禽流感病毒A/C/HB/04，其中重配毒株T+H(HA/NA)的致病力又強(qiáng)于T+H(HA)。結(jié)果表明豬流感病毒A/S/TJ/04在獲得禽流感病毒A/C/HB/04的HA或HA和NA基因后致病力和組織嗜性都有所增強(qiáng)，在跨種傳