基因修飾增加枯草芽孢桿菌脂肪酶的分泌.pdf

1、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）表達和分泌的胞外脂肪酶（LipA），是分子量最小的堿性脂肪酶，有重要的應(yīng)用價值。本文以提高脂肪酶分泌水平為研究目的，考查了宿主菌及胞外蛋白缺失，TatAdCd轉(zhuǎn)位酶過表達對脂肪酶發(fā)酵的影響。
　　在B.subtillis168中，通過缺失胞外中性蛋白酶（NprE）和堿性蛋白酶（AprE），構(gòu)建了B.subtilisBNA菌株。用脂肪酶表達質(zhì)粒pHP13L，分別轉(zhuǎn)化B.subtillis168、

2、BNA和DB104菌株，分別篩選出分泌脂肪酶的168/pHP13L、BNA/pHP13L和DB104/pHP13L菌株。搖瓶發(fā)酵顯示，B.subtillisBNA發(fā)酵液中的脂肪酶活性是168菌株的1.5倍，168菌株是DB104菌株的2.5倍。168菌株發(fā)酵液中的脂肪酶活性極不穩(wěn)定，達到最大值后迅速下降。結(jié)果表明，B.subtillis168比DB104更適宜作為脂肪酶發(fā)酵的宿主菌；主要胞外蛋白酶的缺失，有利于維持分泌脂肪酶的穩(wěn)定。

3、r>　　在B.subtilisBNA和DB104菌株中，分別缺失胞外蛋白YolA、YolB、XynA、YncM和Csn，并進行質(zhì)粒pHP13L轉(zhuǎn)化，構(gòu)建BNA和DB104系的衍生菌株BNAY2-5/pHP13L和BDY2-5/pHP13L。搖瓶發(fā)酵顯示，這些衍生菌株胞外蛋白缺失的數(shù)量與其脂肪酶發(fā)酵單位，以及發(fā)酵液中脂肪酶的穩(wěn)定性均呈正相關(guān)。缺失5個胞外蛋白的BNAY5/pHP13L和BDY5/pHP13L菌株，分別在同系菌株中，脂肪酶發(fā)

4、酵單位最高，分別為230和170 U/mL；并且脂肪酶的最大活性可持續(xù)到發(fā)酵60 h。結(jié)果表明，在產(chǎn)脂肪酶的B.subtilis中，缺失分泌量較大的依賴Sec途徑分泌的胞外蛋白，能夠在一定程度上減少Sec途徑的分泌壓力，有助于提高脂肪酶的分泌水平。
　　分別在B.subtilisBNA和BNAY5菌株中，在染色體sacB基因位點，整合過表達tatAD-tatCD操縱子，構(gòu)建了B.subtilisBNAT/pHP13L和BNAY5T