一種檢測(cè)兒茶酚-O-甲基化轉(zhuǎn)移酶熒光探針的設(shè)計(jì)合成及其生物應(yīng)用.pdf

1、COMT（Catechol-O-methyltransferase，兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）是人體內(nèi)一種重要的的二相代謝酶，可以代謝內(nèi)源性和外源性兒茶酚類化合物，對(duì)機(jī)體的防御也起著重要的作用。COMT的催化功能（即活性）是其在機(jī)體發(fā)揮功能的前提條件，COMT催化功能的失常會(huì)導(dǎo)致人體多種疾病的發(fā)生甚至死亡。因此，評(píng)價(jià)和表征COMT催化功能十分重要。基于特異性探針分子檢測(cè)目標(biāo)酶催化功能的手段已得到普遍認(rèn)同，但現(xiàn)行COMT催化功能表征探針及檢

2、測(cè)體系受以下條件制約或有以下缺陷:1.原理上，需要定量檢測(cè)酶代謝的專一產(chǎn)物，特別是單一產(chǎn)物的生成量，而不是底物的減少量;2.COMT具有兩種形式，在生理狀態(tài)下底物的選擇性并沒有差異，所以對(duì)COMT活性的評(píng)價(jià)是同時(shí)評(píng)價(jià)兩種類型COMT的活性;3.COMT即是膜蛋白也是游離蛋白，其催化功能需要膜結(jié)構(gòu)的完整性或胞漿和輔因子的存在，反應(yīng)體系的復(fù)雜性影響到不同生物基質(zhì)或/和內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)COMT催化表征的穩(wěn)定性和抗干擾性;4.COMT活性常常需要活

3、細(xì)胞水平的檢測(cè)，因此，底物探針或者代謝產(chǎn)物不能對(duì)活性細(xì)胞體系形成毒性傷害;5.已報(bào)道的COMT探針底物均為非熒光底物，未經(jīng)理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化，反應(yīng)檢測(cè)體系需要借助高效液相色譜-紫外或高效液相色譜-質(zhì)譜等大型貴重儀器來實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的分離與檢測(cè)，具有流程繁瑣、測(cè)試通量低、成本高、生物基質(zhì)干擾大等缺陷。
　　針對(duì)上述在選擇性、穩(wěn)定性、靈敏性、抗干擾性、實(shí)用性等方面的挑戰(zhàn)和限制，本論文開展了以下工作，1.以高靈敏性和抗干擾性較好的香豆素?zé)晒夥肿訛?/p>

4、母體，構(gòu)建了4位取代不同，極性大小不同的小分子熒光化合物庫8個(gè)，最終發(fā)現(xiàn)COMT能夠高選擇性的將探針DHMC（4-methyl-7，8-dihydroxycoumarin，7，8-二羥基-4-甲基香豆素）甲基化成HMMC（4-methyl-7-hydroxy-8-methoxycoumarin，7-羥基-8-甲氧基-4-甲基香豆素）;2.利用體外重組單酶，系統(tǒng)研究了探針對(duì)底物的選擇性;3.結(jié)合COMT偏好的底物結(jié)構(gòu)特征，通過選擇香豆素7

5、，8位兒茶酚COMT代謝的傾向性和代謝選擇性，發(fā)現(xiàn)COMT選擇性代謝8位羥基，只產(chǎn)生一個(gè)產(chǎn)物;4.對(duì)COMT熒光底物及其相應(yīng)甲基化產(chǎn)物的探針性能，包括熒光量子產(chǎn)率、pH穩(wěn)定性、激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)等和COMT酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)熒光探針具有很好的穩(wěn)定性和抗干擾能力;5.將新發(fā)現(xiàn)的探針和反應(yīng)檢測(cè)體系進(jìn)行了生物應(yīng)用，包括1）人源性組織或生物樣本中COMT酶活的定量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COMT活性檢測(cè)與傳統(tǒng)COMT定量方法結(jié)果一致;2）人