高糖對人系膜細(xì)胞CTGF及其受體LRP表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：
　　 眾所周知，高血糖是導(dǎo)致糖尿病腎臟病(Diabetic kidneydisease，DKD)的始動因素，因此探討高糖對腎臟的影響及其作用機(jī)制成為早期防治DKD研究的必然環(huán)節(jié)。關(guān)于高血糖對腎臟的影響及相關(guān)機(jī)制的動物實驗研究已不勝枚舉，但高糖對人體腎臟組織細(xì)胞的具體危害及其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步明確，因此這方面的研究成了本領(lǐng)域的研究熱點。尤其是高糖通過各種細(xì)胞因子、各種信號途徑對腎臟固有細(xì)胞如系膜細(xì)胞、足細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)

2、胞及腎小管上皮細(xì)胞的影響等方面的研究越來越多，越來越深入。高糖對腎臟結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)的表達(dá)的影響和相應(yīng)機(jī)制研究正是目前研究的熱點之一。
　　 系膜細(xì)胞具有重要的生理功能：是腎小球毛細(xì)血管叢的主要支架，具有收縮、分泌功能，可以通過其系膜細(xì)胞膜上的血管活性物質(zhì)受體，根據(jù)機(jī)體需要調(diào)節(jié)收縮從而改變腎臟濾過膜的濾過面積；系膜細(xì)胞還具有很強(qiáng)的吞噬能力，對清除腎小球濾

3、過的某些大分子物質(zhì)起著重要作用。眾所周知，高血糖是DKD發(fā)生始動因素和核心因素，而系膜細(xì)胞的上述生理學(xué)特性決定了它是糖尿病眾多致病因子作用的主要靶細(xì)胞之一。然而，人類腎小球系膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)一直存在不少困難，諸如：培養(yǎng)細(xì)胞的成功率低、生存時間較短，傳代困難或傳代次數(shù)太少等問題，從而阻礙了針對人腎小球系膜細(xì)胞的實驗研究的開展，極大地影響了腎小球相關(guān)疾病研究的進(jìn)展。
　　 CTGF作為一種富含半胱氨酸的分泌型蛋白，具有很強(qiáng)的促纖維化

4、效應(yīng)。目前已知，CTGF的主要作用機(jī)理是通過自分泌、旁分泌等方式來誘導(dǎo)多種細(xì)胞的分化、增殖，并且參與介導(dǎo)這些細(xì)胞的遷移、黏附、聚集，促進(jìn)組織細(xì)胞外基質(zhì)的合成和沉積，從而導(dǎo)致相應(yīng)靶器官的纖維化。另外，已證實CTGF還具有誘導(dǎo)血管生成、參與組織細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等一系列生物學(xué)功能。CTGF在人體多種組織器官中廣泛存在，它作為一種重要的細(xì)胞因子參與了細(xì)胞外基質(zhì)合成和沉積，而后者正是組織纖維化的一個重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)腎臟是人體眾多組

5、織器官中含有CTGF最多的器官之一，腎臟的多種固有細(xì)胞均可表達(dá)CTGF，并在某些因素如氧化應(yīng)激、缺氧、高糖等作用下出現(xiàn)高表達(dá)。已有實驗證實，CTGF可通過介導(dǎo)糖基化終末產(chǎn)物這一經(jīng)典途徑促進(jìn)腎臟系膜細(xì)胞合成膠原蛋白和纖維黏連蛋白，從而參與了腎臟纖維化的進(jìn)展。新近研究不僅在DKD動物模型的腎臟組織中發(fā)現(xiàn)了CTGF的高表達(dá)，而且在DKD患者腎臟組織中也有類似的發(fā)現(xiàn)，因此認(rèn)為CTGF作為一種非常重要的促纖維化因子在DKD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要

6、作用。
　　 本課題組近年的研究顯示，在糖尿病大鼠腎臟病變早期就已經(jīng)開始出現(xiàn)腎組織中CTGF的高表達(dá)以及血、尿CTGF濃度的增加，而且血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑厄貝沙坦可通過降低血CTGF水平來減輕糖尿病大鼠腎臟損傷。另外也有學(xué)者檢測到1型糖尿病患者血漿中CTGF水平升高，并且這種變化甚至在微量白蛋白尿出現(xiàn)之前就已經(jīng)發(fā)生，而且其水平的變化與患者的蛋白尿水平和腎功能(內(nèi)生肌酐清除率)有著很高的相關(guān)性。以上研究均提示CTGF與DKD的發(fā)

7、生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，該因子今后極有可能成為早期診治DKD以及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。但是上述血和尿中CTGF水平升高的具體來源以及其表達(dá)增加的病理生理意義到目前還不十分清楚。據(jù)已有的文獻(xiàn)報道，CTGF可通過某種機(jī)制誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的腎臟系膜細(xì)胞和足細(xì)胞發(fā)生增生、肥大，而系膜細(xì)胞肥大是DKD早期腎組織的主要病理特征之一。
　　 目的：
　　 1.培養(yǎng)重復(fù)性好、可多次傳代的人腎小球系膜細(xì)胞(HMC)
　　 2.探討高糖環(huán)

8、境對體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞(HMC)表達(dá)結(jié)締組織生長因子(CTGF)及其受體-低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(lowdensity lipoprotein receptor-related protein，LRP)的影響以及相應(yīng)的信號機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.體外HMC培養(yǎng)：取成人腎臟腫瘤術(shù)后相對遠(yuǎn)離腫瘤的腎組織、水囊引產(chǎn)的胎兒腎臟組織，通過3層篩網(wǎng)濾過分離，選取最下層篩網(wǎng)上腎組織，采用膠原酶消化后，培養(yǎng)正常人腎

9、小球系膜細(xì)胞，用系統(tǒng)性觀察和免疫熒光檢查等方法進(jìn)行鑒定后傳代培養(yǎng)。
　　 2.高糖刺激實驗：以體外培養(yǎng)的HMC為研究對象，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ABC-ELISA)測定正常糖組(NG組)、高糖組(HG組)和甘露醇組(MG組)培養(yǎng)液中CTG F、磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phospho-extracellular signal-regulated kinase，pERK)及LPR的濃度變化，分別觀察高糖環(huán)境對系膜細(xì)胞CTG

10、F蛋白表達(dá)、絲裂素激活蛋白激酶(MAPKS)信號通路的活化以及CTGF受體LRP表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)形態(tài)學(xué)、免疫熒光檢查等方法鑒定證實培養(yǎng)細(xì)胞是腎小球系膜細(xì)胞，成人腎臟原代培養(yǎng)2周后才可傳代，胎兒腎系膜細(xì)胞原代培養(yǎng)1周即可傳代，且可連續(xù)培養(yǎng)至第7代以上。
　　 2.H MC本身存在基礎(chǔ)水平的CTGF蛋白表達(dá)，在高糖環(huán)境中培養(yǎng)1 d后，CTGF蛋白表達(dá)升高，峰值出現(xiàn)在第3d，自第4d開始下降；而

11、對照組CTGF蛋白表達(dá)未隨時間發(fā)生顯著變化；高糖環(huán)境下HMC外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)出現(xiàn)動態(tài)活化：1 h即開始檢測到pERK升高，峰值出現(xiàn)在第8至24h，于48h內(nèi)降至基礎(chǔ)水平，而對照組在各時點均未能檢測到pERK表達(dá)；加入PD98059(ERK活化特異抑制劑)后發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境對HMC表達(dá)CTGF蛋白增加的影響被抵消；另外，高糖環(huán)境未影響LRP的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用3層濾網(wǎng)分離人腎小球系膜細(xì)胞法簡便高效，所