PRS-CTGF-siRNA對高糖誘導的人腎小管上皮細胞CTGF及細胞外基質(zhì)表達的影響.pdf

1、腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)幾乎是所有慢性腎臟疾病進行性發(fā)展的共同通路。與腎功能惡化密切相關(guān)，是進展性腎病的主要病理特征。研究表明，多種細胞因子參與調(diào)節(jié)TIF，其中轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β起到中樞作用。但TGF-β生物學效應(yīng)復雜，完全阻斷其表達并不現(xiàn)實。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth fact

2、or，CTGF)是TGF-β介導的腎間質(zhì)纖維化的重要下游效應(yīng)因子，成為抗纖維化治療新的靶點。 19-29核苷酸的小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)應(yīng)用于哺乳動物細胞能特異性的降解靶mRNA，導致基因沉默。病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是目前介導DNA或RNA片段轉(zhuǎn)移最有效的方法。因此使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導siRNA阻斷CTGF表達或抑制其活性，可能是一種更特異、更有效地防治腎纖維化的手段。

3、本研究在體外觀察高糖對人近曲小管上皮細胞(HKC)表達CTGF，Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ，col Ⅰ)，纖維粘連蛋(fibronectin，F(xiàn)N)等的影響，以及構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PRS介導的結(jié)締組織生長因子siRNA(命名為PRS-CTGF-siRA高糖誘導效應(yīng)的抑制作用。 方法:(1)構(gòu)建表達人CTGF siRNA的PRS-CTGF-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；(2)體外培養(yǎng)HKC，用不同濃度D-葡萄糖(5.5，30，6

4、0mM)刺激細胞48h；選取30mM D-葡萄糖作用于細胞不同的時間點(0，12，24，48，72h)，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)及Western blot方法檢測HKC中CTGFmRNA和蛋白表達水平的時間和濃度效應(yīng)；(3)選取高糖(30mM，48h)刺激HKC，觀察逆轉(zhuǎn)錄病毒載體PRS介導的結(jié)締組織生長因子siRNA對HKC的影響。實驗分組如下：①對照組(含5.5mM D-葡萄糖的無血清DMEM培養(yǎng))；②高糖組(用含30

5、mM D-葡萄糖的無血清DMEM培養(yǎng))；③高糖+siRNA組(用含30mM D-葡萄糖的無血清DMEM對PRS-CTGF-siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒液感染后的穩(wěn)定細胞培養(yǎng))；④高糖+PRS組(用含30mM D-葡萄糖的無血清DMEM對空載體PRS逆轉(zhuǎn)錄病毒液感染后的穩(wěn)定細胞培養(yǎng))；⑤代謝滲透壓對照組(含24.5mM甘露醇無血清DMEM培養(yǎng))。用RT-PCR測定CTGF,colI，F(xiàn)N mRNA的表達效應(yīng)，western blot方法測定col

6、I,CTGF蛋白水平的影響。每組重復實驗5次，取3次結(jié)果計算，以平均值士標準差表示。 結(jié)果：經(jīng)酶切與測序證實PRS-CTGF-siRNA構(gòu)建成功；高糖以劑量依賴和時間依賴方式上調(diào)HKC中CTGFmRNA表達；在高糖(30mM，48h)刺激下，colI，F(xiàn)N mRNA表達量亦顯著增加(P<0.01)，PRS-CTGF-siRNA能可顯著抑制HKC CTGF,FN和colI mRNA表達的增加(p<0.01)，亦可明顯抑制胞內(nèi)CTG