受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制大鼠異位小腸移植急性排斥反應(yīng)機(jī)制的實驗研究.pdf

1、第一部分、大鼠異位節(jié)段性小腸移植急性排斥反應(yīng)模型的建立
　　 目的：建立近交系BN-Lew大鼠異位節(jié)段性小腸移植的動物模型，通過移植物病理組織學(xué)觀察，確定急性排斥反應(yīng)的合適研究時間點。
　　 方法：利用顯微外科技術(shù)分別構(gòu)建BN-Lew異系和Lew-Lew同系兩組大鼠異位節(jié)段性小腸移植模型，術(shù)后1、3、5、7天分別留取移植腸組織進(jìn)行HE染色，觀察排斥反應(yīng)的發(fā)生及程度。
　　 結(jié)果： BN-Lew異系移植腸術(shù)后第3天

2、開始出現(xiàn)輕度急性排斥反應(yīng)，第5—7天出現(xiàn)嚴(yán)重的急性排斥反應(yīng)。Lew-Lew同系移植腸無明顯急性排斥反應(yīng)發(fā)生。
　　 結(jié)論： BN-Lew大鼠異位節(jié)段性小腸移植模型可以發(fā)生急性排斥反應(yīng)，術(shù)后第7天為合適的研究時間點。
　　 第二部分、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定以及體外免疫抑制功能的實驗研究
　　 目的：體外分離、培養(yǎng)和鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外免疫抑制功能進(jìn)行研究。
　　

3、 方法：采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法進(jìn)行MSCs的分離、培養(yǎng)，傳代擴(kuò)增，利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行表型鑒定。以供鼠脾細(xì)胞作為反應(yīng)T細(xì)胞，受鼠MSCs為刺激細(xì)胞，ConA作為T細(xì)胞增殖刺激因子，建立混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)體系。分4組進(jìn)行對比研究：①脾細(xì)胞；②脾細(xì)胞+MSCs；③脾細(xì)胞+ConA；④脾細(xì)胞+ConA+MSCs。共孵育72小時后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測T細(xì)胞亞群CD4+和CD8+的表達(dá)，分析MSCs對T細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 結(jié)果：

4、>　　 1.體外分離的原代MSCs在48-72小時大部分貼壁，3周左右達(dá)到90％匯合，細(xì)胞形態(tài)由圓形過度到梭形。
　　 2.流式細(xì)胞技術(shù)檢測第3代MSCs表面標(biāo)記物CD29、CD90陽性率大于95％，CD45陽性率低于5％。
　　 3.CD4+細(xì)胞比例：脾細(xì)胞+MSCs組與脾細(xì)胞+ConA組間無差別，其它組間差異顯著；脾細(xì)胞+ConA+MSCs組與脾細(xì)胞+ConA組差異最顯著；CD8+細(xì)胞比例：脾細(xì)胞組與脾細(xì)胞+MSC

5、s組、脾細(xì)胞+ConA組和脾細(xì)胞+ConA+MSCs組間無差異，脾細(xì)胞+MSCs組、脾細(xì)胞+ConA組和脾細(xì)胞+ConA+MSCs組間差異顯著；CD4/CD8：除脾細(xì)胞+ConA組和脾細(xì)胞+ConA+MSCs組間無差異外其余組間差異均有顯著性。
　　 結(jié)論：全骨髓貼壁培養(yǎng)法可取得較高純度的MSCs，大鼠骨髓MSCs增殖能力強，可多次傳代。MSCs在體外具有機(jī)制T淋巴細(xì)胞增殖的作用，以對CD4+的抑制為主，對CD8+的抑制作用不明

6、顯。
　　 第三部分、受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制大鼠小腸移植急性排斥反應(yīng)機(jī)制的研究
　　 目的：研究受體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制大鼠小腸移植急性排斥反應(yīng)的機(jī)制。
　　 方法：將實驗動物隨機(jī)分為4組：①Lew-Lew同系對照組；②BN-Lew急性排斥組；③急性排斥+FK506治療對照組；④急性排斥+MSCs治療組。術(shù)后第7天留取移植腸標(biāo)本，病理切片觀察排斥反應(yīng)程度。PCRArray的方法對大鼠免疫相關(guān)的所有細(xì)胞因子的基因

7、轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測分析比較。
　　 結(jié)果：急性排斥組較同系對照組IDO和HGF表達(dá)顯著降低，Tnfsfl5表達(dá)顯著升高；急性排斥+FK506治療對照組較急性排斥組。IDO和HGF表達(dá)顯著升高，Tnfsfl5和Igf2顯著降低；急性排斥+MSCs治療組較急性排斥組Tnfsfl5顯著降低，伴、Il1a、VEGF-A、Igfbp6顯著升高，Igf2、iNOs、Igfbp1、Tgfb1的顯著降低；急性排斥+MSCs治療組較急性排斥+FK5

8、06治療對照組IDO和Tgfb1顯著降低，VEGF-A、Il15和Ccr3顯著升高；急性排斥+MSCs治療組較同系對照組VEGF-A和Il15顯著升高，IDO、Igf2、Ifng、Lta、Tgfb1、Cc14和Il18顯著降低；急性排斥+FK506治療對照組較同系對照組Cc14、CCR3、Igf2和Tgfb1顯著降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.IDO、HGF和Tnfsfl5這三種細(xì)胞因子相關(guān)的途徑在大鼠小腸移植急性排斥反