骨髓間充質干細胞干預異種氣管移植免疫排斥反應的實驗研究.pdf

1、第一部分 異種氣管移植動物模型的建立 目的:建立一種簡單的豚鼠-SD大鼠異種氣管移植動物模型，為下一步研究其免疫排斥反應特點及干預措施奠定基礎，為解決臨床上供體氣管來源問題提供新方向。 方法:采用“加植法”建立了一種新型的短段(5個氣管環(huán))異種原位氣管移植動物模型，觀察術后受體存活時間、移植氣管在光鏡和電鏡下的病理組織學改變，初步分析其免疫排斥反應特點。 結果:單人操作連續(xù)進行20例異種氣管移植，手術成功

2、率達100％(20/20)，受體手術時間(20.8±1.6)min，無重要手術并發(fā)癥。受體術后存活最短8.0d，最長12.5d，平均(10.O±1.3)d。移植氣管隨著時間延長逐漸出現(xiàn)管腔狹窄，粘膜上皮、粘膜下、外膜及軟骨逐漸出現(xiàn)不同程度淋巴細胞、嗜酸粒細胞、單核巨噬細胞的浸潤以及細胞凋亡現(xiàn)象。 結論:以“加植法”建立的短段(5個氣管環(huán))異種氣管移植動物模型，術后移植段氣管的病理變化符合異種氣管移植免疫排斥反應的一般特點，是一種

3、簡便、經濟實用、穩(wěn)定可靠和易于復制的器官移植研究動物模型。 第二部分 SD大鼠骨髓間充質干細胞體外培養(yǎng)、表型鑒定與標記 目的:探討SD大鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)的體外分離培養(yǎng)、表型鑒定和標記的方法，為迸一步研究MSCs干預異種氣管移植的免疫排斥做好準備。 方法:采用直接貼壁法分離培養(yǎng)MSCs；通過流式細胞儀檢測細胞表面標志抗原CD90、CD45的表達率對培養(yǎng)的MSCs進行表型鑒定；DAPI標記第3代

4、MSCs，觀察標記效率。 結果:體外培養(yǎng)的原代MSCs48h內可見有少量貼壁細胞，7～10d左右達到90％匯合；流式細胞儀檢測第3代MSCs表面標記物CD90、CD45的陽性率分別為99.8％、6.8％，提示MSCs表達CD90而不表達CD45；用DAPI進行細胞標記后，熒光顯微鏡下見幾乎所有MSCs均已被標記藍色熒光，提示DAPI標記法敏感性好，標記效率高。 結論:貼壁培養(yǎng)法是一種簡便易行的培養(yǎng)MSCs方法，操作簡單，

5、成功率高，可以作為培養(yǎng)SD大鼠MSCs的常規(guī)方法；DAPI標記可作為標記MSCs的一種有效手段。 第三部分 骨髓間充質干細胞對異種氣管移植免疫排斥反應的影響 目的:通過靜脈移植的方式將骨髓間充質干細胞(MSCs)輸入豚鼠-大鼠異種氣管移植后的受體，進一步研究異種氣管移植的排斥反應特點及MSCs對其免疫干預作用，為解決臨床上氣管移植術后抗排斥問題提供新思路。 方法:實驗分成4組：A組(自體移植，n=17)；

6、B組(異種移植，n=20)；C組(異種移植+CsA，n=25)；D組(異種移植+MSCs，n=25)。記錄受體存活時間，觀察移植氣管病理組織學變化及氣管通暢度，流式細胞儀檢測外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞含量的變化，移植氣管冷凍標本免疫熒光檢查IgG、IgM、C3的沉積，TUNEL法檢測移植物細胞凋亡并計算凋亡指數(shù)(AI)，生化分析儀檢測外周血肌酐(CREA)的變化。 結果:(1)異種移植后各組受體平均存活時間分別為：B組(

7、10.0±1.3)d、C組(17.1±2.7)d、D組(17.6±3.2)d，C、D組生存時間顯著長于B組(P＜0.01)。(2)各組移植氣管病理積分和通暢度的比較：異種移植后的各組與自體移植組相比，病理積分顯著增加(P＜0.01)而通暢度顯著下降(P＜0.01)，表現(xiàn)均為急性排斥改變：C、D組病理損害比B組輕，說明排斥反應被減輕。(3)外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞含量的比較：異種移植后的各組比自體移植組顯著增加，隨時間持續(xù)升高，

8、說明T細胞被激活參與了急性免疫排斥反應；B組增加最明顯，C、D組低于B組，說明細胞免疫被抑制。(4)免疫熒光檢查結果比較：自體移植組未見IgG、IgM、C3的沉積，異種移植后的各組可見不同程度的IgG、IgM、C3沉積，說明體液免疫和補體系統(tǒng)參與了急性排斥反應；B組IgG、IgM、C3復合物沉積最明顯，D組低于B組，說明MSCs對體液免疫和補體系統(tǒng)具有調節(jié)作用。(5)移植氣管細胞凋亡的比較：自體移植組AI顯著低于異種移植后的各組(P＜0

9、.01)，B組移植物AI最高與C、D組比較差異有顯著性(P＜0.01)。(6)外周血肌酐(CREA)的比較：C組隨時間的延長逐漸增加，其余3組則基本不變。 結論:細胞免疫、體液免疫均參與了豚鼠-大鼠異種氣管移植的急性排斥反應；靜脈移植MSCs可明顯延長異種氣管移植受體的存活時間，增加移植氣管通暢度，抑制細胞凋亡，減輕免疫排斥反應；MSCs可能通過對免疫細胞和補體系統(tǒng)的調節(jié)等多方面因素干預免疫排斥反應；MSCs抗排斥效力與CsA相