人骨髓間充質(zhì)干細胞在大鼠腦內(nèi)移植的研究.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)又稱骨髓基質(zhì)細胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)，是骨髓中除造血干細胞外的一種多向分化潛能的成體干細胞，是目前干細胞研究的熱點和前沿。MSCs具有方便獲取、易于分離培養(yǎng)和擴增純化，在體外培養(yǎng)條件下多代擴增后仍保持多向分化潛能的特點，且遺傳背景穩(wěn)定，體內(nèi)植入后免疫排斥反應(yīng)弱，體外基因轉(zhuǎn)染后能長期穩(wěn)定表達外源基因。近年研究發(fā)現(xiàn)MSCs具有跨系統(tǒng)

2、、跨胚層分化的潛能，即不僅具有向中胚層分化的能力，而且具有向內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞分化的能力。尤其MSCs向神經(jīng)細胞系轉(zhuǎn)分化的體內(nèi)、外研究引起廣泛興趣。諸多學(xué)者將自體或同種異基因MSCs通過腦內(nèi)局部注射、腹腔內(nèi)注射或靜脈輸注等方法移植至多種神經(jīng)元變性疾病動物模型中，包括局灶性腦缺血(即腦梗塞)、腦出血、腦外傷、帕金森氏病等，研究發(fā)現(xiàn)自體或異基因MSCs植入后能歸巢至腦內(nèi)損傷部位，長期存活，部分細胞分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞，甚

3、至能顯著改善神經(jīng)系統(tǒng)功能。因此，MSCs在神經(jīng)系統(tǒng)中有著廣泛的應(yīng)用前景。但MSCs在缺氧缺血導(dǎo)致的彌漫性腦損疾病的研究國內(nèi)、外報道并不多。此外，嚙齒類動物來源MSCs在神經(jīng)損傷疾病中的神經(jīng)保護效應(yīng)已被廣泛證實，而人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)在體內(nèi)的研究較少。由于MSCs獨特的免疫學(xué)特性，有學(xué)者將異種MSCs植入免疫功能健全大鼠腦內(nèi)，結(jié)果用或不用免疫抑制劑，MSCs均能在體內(nèi)長期存活，且未見明顯免疫排斥反應(yīng)。因此，本實驗探討未用免疫抑

4、制劑下，hMSCs在免疫功能健全的異種動物體內(nèi)能否存活、遷移、分化，能否促進大鼠缺氧缺血導(dǎo)致的彌漫性腦損傷的修復(fù)。 實驗動物隨機分為4組：hMSCs移植組(n=18)，移植對照組(n=18)，模型組(n=6)和假手術(shù)組(n=6)，前三組采用Rice法建立幼年Wistar大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型。采用密度梯度離心貼壁法分離培養(yǎng)hMSCs，傳代培養(yǎng)后，取3-5代hMSCs，移植前加入胸腺嘧啶類似物：5-溴脫氧尿嘧啶核苷(

5、BrdU)連續(xù)標記72h，消化收集細胞調(diào)整濃度為5×104個/ul。緩慢注射約5×105個hMSCs(5ul×2個注射點)至hMSCs移植組大鼠左背側(cè)海馬，移植對照組注射等體積的PBS，模型組和假手術(shù)組大鼠分別只制備HIBD模型和假手術(shù)模型，未作移植。4組大鼠均未用免疫抑制劑。 hMSCs移植組與移植對照組分別于移植后0d，3d，1w,2w,4w處死，模型組和假手術(shù)組于造模后31d(即移植之日后4w)處死。4組于移植后4w處死前

6、行交替電刺激Y迷宮行為學(xué)試驗表明，hMSCs移植組大鼠空間記憶能力顯著優(yōu)于移植對照組大鼠，而hMSCs移植組與假手術(shù)組，移植對照組和模型組大鼠的空間記憶能力無顯著性差異。大鼠灌注處死后，腦組織制備石蠟切片，行HE染色觀察病理變化，示移植對照組與模型組大鼠腦皮質(zhì)、海馬大量神經(jīng)元壞死，毛細血管擴張充血、滲血，神經(jīng)毯疏松、空泡形成，海馬CA1區(qū)甚至整個海馬結(jié)構(gòu)紊亂，大量膠質(zhì)細胞增生。hMSCs移植組和假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)和海馬也有部分壞死神經(jīng)元，

7、但結(jié)構(gòu)正常，無空泡。各組各時間點大鼠處死后，制備石蠟切片，行BrdU、巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)絲蛋白(NF)和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)免疫組化檢測hMSCs在腦內(nèi)的分布并鑒定有無表達神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞表型。實驗顯示，移植后1whMSCs主要沿腦室系統(tǒng)遷移，部分細胞沿胼胝體向?qū)?cè)遷移，移植后4w細胞沿腦室向周圍實質(zhì)遷移，廣泛分布于腦組織。移植后3d，移植局部即有部分BrdU陽性細胞表達GFAP，移植周圍的血管附近少量BrdU陽性

8、細胞表達NF。各時間點均未見Nestin表達。移植后4w，BrdU、GFAP共表達細胞增多，主要分布在移植局部、海馬、皮質(zhì)、室管膜。 綜上所述，本研究得到以下結(jié)論： 1.Rice法可成功制備以結(jié)扎側(cè)海馬、皮質(zhì)為主的彌漫性腦內(nèi)神經(jīng)元進行性壞死的幼年大鼠缺氧缺血性腦損傷(HIBD)模型。 2.未用免疫抑制劑下，hMSCs在免疫功能健全的異種(大鼠)腦內(nèi)至少能存活4周，且大鼠未發(fā)生移植相關(guān)的死亡。 3.腦內(nèi)移植