矮沙冬青抗凍蛋白基因(AnAFP)功能驗(yàn)證.pdf

1、抗凍蛋白(Antifreeze protein，AFP)是寒區(qū)動(dòng)物、植物和真菌為了在嚴(yán)寒的環(huán)境下生存而產(chǎn)生的一類多肽。矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus)是中亞沙漠地區(qū)獨(dú)有的四季常綠闊葉灌木，它是在第三紀(jì)古地中海消失后幸存在塔里木盆地西部邊緣的古老物種，其分布區(qū)域常年都是干旱氣候且具有-30℃到40℃的極端溫度。
　　在本研究中，我們通過PCR擴(kuò)增出矮沙冬青抗凍蛋白基因（AnAFP），生物信息學(xué)分析其可能存在的功能

2、，構(gòu)建AnAFP基因的原核表達(dá)載體和植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli和煙草（Nicotiana benthamiana）。根據(jù)轉(zhuǎn)化菌株與野生型對照在低溫條件下的存活率，和轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草在低溫條件下的耐寒性差異，驗(yàn)證AnAFP基因的功能。
　　研究結(jié)果如下:
　　1.生物信息學(xué)分析表明，AnAFP與豆科植物的多種抗逆相關(guān)蛋白同源。其中，AnAFP與蒙古沙冬青（Ammopiptanthus m

3、ongolicus）冷誘導(dǎo)蛋白(cold-induced protein，GenBank no.AAT01285.1)同源性最高(68％);AnAFP蛋白具有高甘氨酸含量(23.2％)，與冬季歐白英（Solanum dulcamara）抗凍蛋白類似(甘氨酸含量23.7％); AnAFP是一個(gè)具有親水性且穩(wěn)定的蛋白;它沒有信號肽，既不是跨膜蛋白，也不是分泌蛋白，可能在細(xì)胞質(zhì)中起作用;二級結(jié)構(gòu)中不規(guī)則卷曲(random coils)所占比例

4、高達(dá)72.91％，這是Ⅱ型AFP的特征。這些分析都表明此蛋白具有抗凍蛋白應(yīng)有的特性。
　　2.將AnAFP基因插入pET-32a質(zhì)粒，構(gòu)建原核表達(dá)載pET-32a-AnAFP，用以轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，ITPG)誘導(dǎo)表達(dá)，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pET-32a-AnAFP體的菌株明顯多出一條大約42

5、kDa的蛋白帶，而其他三個(gè)對照組沒有，表明AnAFP基因在大腸桿菌中異源過表達(dá)。
　　3.0℃低溫脅迫處理轉(zhuǎn)化菌株及其對照，通過稀釋涂板計(jì)數(shù)后，分別統(tǒng)計(jì)其存活率。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌株存活率明顯高于未經(jīng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化菌株，空載體轉(zhuǎn)化菌株，以及未轉(zhuǎn)化的野生型菌株，表明其抗寒能力明顯增強(qiáng)。
　　4.構(gòu)建植物表達(dá)載體pRI201-GUS-AnAFP，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草品種“Wisconsin38”，通過卡那篩選得到了100多株T0代

6、再生植株，大約1/3特異經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測為陽性，其中3株GUS染色呈現(xiàn)藍(lán)色。對這3株自交T1代株系的再次特異PCR檢測和Southern雜交表明，這3株是相互獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測T2代煙草株系A(chǔ)nAFP基因在低溫(-3℃)脅迫條件下的差異表達(dá)。結(jié)果表明，AnAFP基因的相對表達(dá)量在低溫脅迫初期略有下降，隨后逐漸升高，在4-12h時(shí)達(dá)到最大值。不同的株系間略有差異，但變化趨勢大致相同。由此說明，AnAFP

7、基因在轉(zhuǎn)基因煙草中異源表達(dá)，且響應(yīng)低溫脅迫。
　　6.在低溫(-3℃)脅迫的不同時(shí)間段取樣，測定煙草葉片相對電導(dǎo)率的變化。在低溫脅迫下，T2代轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)基因野生型對照的相對電導(dǎo)率都明顯增強(qiáng)，但是轉(zhuǎn)基因株系相對電導(dǎo)率的增長幅度明顯低于野生型對照。由此說明，轉(zhuǎn)基因株系煙草細(xì)胞質(zhì)膜的滲透性在低溫脅迫條件下更為穩(wěn)定，可能利于耐寒性的增強(qiáng)。
　　7.將T2代轉(zhuǎn)基因株系及未轉(zhuǎn)基因野生型對照置低溫(-3℃)脅迫處理16h，然后轉(zhuǎn)室溫