沙冬青ErbB3結(jié)合蛋白基因轉(zhuǎn)化杏的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、中國杏種資源豐富分布廣泛,由于北方春季有低溫和晚霜,容易使杏花、幼果受凍,產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益受到極大損失,因此選育高抗寒杏具有重要的意義。傳統(tǒng)的植物育種方法在改善植物耐寒性方面取得的成功非常有限,利用傳統(tǒng)方法選育抗寒杏,育種周期長,且抗寒效果不顯著,且杏樹的抗寒研究多集中在抗寒生理方面。利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)對杏進(jìn)行抗寒性選育,更具高效性和針對性,可以加速高寒杏新種質(zhì)的選育進(jìn)程。植物低溫條件下,體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成與其抗寒性密切相關(guān)。沙冬青ErbB

2、3結(jié)合蛋白基因(AmEBP1)是沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus Cheng f.)中與低溫脅迫相關(guān)的基因,低溫條件下,能夠抑制植物細(xì)胞翻譯因子(eIF2a)的磷酸化,調(diào)控eIF2a的活性,保證蛋白質(zhì)的正常合成,從而提高植物抗寒能力。本研究以沙冬青總RNA反轉(zhuǎn)錄所得cDNA第一條鏈為模板克隆了AmEBP1基因編碼區(qū)序列,通過酶切和連接反應(yīng)構(gòu)建載體并轉(zhuǎn)化到杏幼胚中,經(jīng)幼胚培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株,并對轉(zhuǎn)基因植株的耐寒性

3、能進(jìn)行了研究,為培育抗寒杏新種質(zhì)打下了基礎(chǔ)。主要研究如下:
  ⑴以沙冬青總RNA為模板,RT-PCR方法克隆得到目的基因AmEBP1,PCR與測序結(jié)果表明,與GeneBank公布的AmEB P1的cDNA(DQ519359)序列長度一致;
  ⑵構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-22b-AmEBP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌,0℃時(shí)轉(zhuǎn)化AmEBP1的大腸桿菌存活率是轉(zhuǎn)化空載體的3倍,可以看出,表達(dá)了AmEBP1的大腸桿菌具有明顯較強(qiáng)的抗寒性;

4、r>  ⑶大果、岱玉等6個(gè)早熟杏品種,不完全花比率差異顯著,其中以大果杏不完全花比率最低,僅為11.62%,紅荷包最高,高達(dá)80.91%,岱玉50.08%,金太陽27.22%,新世紀(jì)25.43%;座果率大果杏最高可達(dá)29.34%,其次是金太陽,岱玉坐果為7.23%,最低的為紅荷包;
  ⑷以大果杏花期后30d幼胚為材料,建立了杏幼胚培養(yǎng)體系。WPM培養(yǎng)基作為大果杏的基本培養(yǎng)基,蔗糖10g·L-1,瓊脂8 g·L-1,pH調(diào)至5.8

5、;幼胚誘導(dǎo)芽叢的培養(yǎng)基選擇WPM+6-BA0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L-1;芽團(tuán)生根培養(yǎng)基宜選擇WPM+ NAA0.1mg·L-1+6-BA0.8 mg·L-1+IBA0.2mg·L-1培養(yǎng)基;
 ?、蓸?gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-AmEBP1,利用花粉管通道與基因槍結(jié)合方法轉(zhuǎn)化大果杏,轉(zhuǎn)化后的幼胚材料先接種WPM+Kan50mg·L-1篩選后,轉(zhuǎn)移到WPM+6- BA0.8mg·L-1+NAA0.2mg·L

6、-1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化擴(kuò)繁,再將擴(kuò)繁材料轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)成苗;
 ?、蕦PM+Kan50mg·L-1篩選后的材料進(jìn)行PCR檢測,得到6個(gè)陽性植株;進(jìn)一步Southern檢測得出此6株系分別出現(xiàn)1-3條雜交帶,Southern結(jié)果說明AmEBP1基因已經(jīng)整合到這6個(gè)株系的基因組DNA中;將單拷貝轉(zhuǎn)基因株系1、6進(jìn)行RT-PCR結(jié)果顯示AmEBP1基因在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá);且多帶擴(kuò)繁后目的基因能穩(wěn)定存在芽切苗中;
  ⑺將轉(zhuǎn)基

7、因陽性株系1、6在分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽叢,再將芽叢切成帶個(gè)芽的芽團(tuán)PCR檢測,剔除陰性,繼續(xù)分化誘導(dǎo)到一定基數(shù),在誘導(dǎo)生根成苗,進(jìn)行下一步抗寒試驗(yàn)??购囼?yàn)結(jié)果顯示:相同低溫(-4和-8℃)條件下,轉(zhuǎn)基因植株均比對照表現(xiàn)出較高的成活率;隨著處理溫度的降低,轉(zhuǎn)基因株系REC與MDA含量始終低于對照植株,但可溶性蛋白含量明顯高于對照;轉(zhuǎn)基因植株的低溫半致死溫度(LT50)比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?.13℃;抗寒試驗(yàn)的其他酶活、可溶性物質(zhì)的含量結(jié)果也說

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