黑色素細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合構(gòu)建組織工程皮膚的初步研究.pdf

1、皮膚缺損創(chuàng)面修復(fù)是整形外科臨床常見問題之一。目前廣泛采用自/異體皮膚移植修復(fù)皮膚創(chuàng)面缺損，但是這種方法存在著皮膚來源受限、對機體產(chǎn)生二次創(chuàng)傷等缺陷。組織工程皮膚的研發(fā)和應(yīng)用為皮膚缺損修復(fù)提供了新的治療策略。目前已有組織工程化的真皮和全層皮膚等產(chǎn)品上市，然而這些“人工皮膚”目前僅發(fā)揮遮蓋創(chuàng)面和加速愈合的功能，尚不是真正意義上的具有色澤、排汗、生發(fā)等生物學(xué)功能的正?！捌つw”組織，因而構(gòu)建具有正常生物學(xué)功能的組織工程皮膚是該領(lǐng)域今后需重點關(guān)注

2、的研究課題。皮膚中的黑色素細胞對于皮膚色澤的調(diào)節(jié)以及防止紫外線照射引起的細胞損傷起著重要的作用。本研究在前期以骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)為種子細胞構(gòu)建組織工程全層皮膚的研究基礎(chǔ)上，將黑色素細胞與BMSCs以適合的比例混合培養(yǎng)，并利用I型膠原膜為支架材料構(gòu)建含有色素細胞的組織工程皮膚，為研發(fā)具有色素功能的組織工程皮膚提供理論依據(jù)。 研究目的： 1、建

3、立獲得大量高純度的黑色素細胞和BMSCs的培養(yǎng)方法，并對兩種細胞進行生物學(xué)性狀鑒定。 2、探索黑色素細胞和BMSCs混和培養(yǎng)的方案，并以二者為種子細胞復(fù)合I型膠原膜體外構(gòu)建含黑色素細胞的組織工程皮膚。 3、評價含黑色素細胞的組織工程皮膚體內(nèi)移植效果。 研究方法： 1、以包皮組織作為細胞來源，用消化法獲得表皮細胞懸液，通過黑色素細胞完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)篩選，并通過低濃度胰酶消化法進行傳代培養(yǎng)，然后對其進行DO

4、PA染色、免疫組化檢測(S-100蛋白)和透射電鏡觀察，以及生長曲線的檢測；同時進行BMSCs的分離培養(yǎng)，對其表面抗原及其多向分化潛能進行鑒定。 2、構(gòu)建I型膠原膜，篩選適合混合培養(yǎng)黑色素細胞和BMSCs的培養(yǎng)基，確定該兩種細胞與I型膠原膜復(fù)合構(gòu)建含有黑色素細胞的組織工程皮膚的方案，并通過免疫組化檢測(S-100蛋白)和掃描電鏡檢測構(gòu)建的組織工程皮膚生物學(xué)性狀。 3、建立裸鼠背部皮膚缺損動物模型，將體外構(gòu)建的含有色素細胞

5、的組織工程皮膚移植到裸鼠背部缺損創(chuàng)面，在術(shù)后不同時間點獲取標(biāo)本，通過大體標(biāo)本觀察、DAPI體內(nèi)示蹤標(biāo)記、HE染色、免疫組化檢測(S-100蛋白)及透射電鏡檢測等方法觀察組織工程皮膚修復(fù)皮膚創(chuàng)面缺損及生成色素情況。 研究結(jié)果： 1、原代培養(yǎng)的黑色素細胞呈多樹突狀，傳至第二代后開始呈現(xiàn)兩極細尖的長梭形，S-100蛋白免疫組化染色及DOPA染色為陽性，透射電鏡觀察胞漿內(nèi)含有大量的黑色素小體；通過骨髓獲得的BMSCs原代培養(yǎng)時最

6、初呈成纖維細胞樣集落生長，傳代后形態(tài)均一，呈寬大的長梭形，擴增后的BMSCs不表達CD34和CD11a；CD29強表達；CD71僅有微弱表達，對數(shù)生長期的細胞中80％以上處于G0/G1期，G2/M期占11％，S期的細胞占7％左右，染色體核型分析為女性正常核型。BMSCs在向脂肪細胞誘導(dǎo)后第5～6天胞漿內(nèi)就有小的脂滴出現(xiàn)，誘導(dǎo)第2周時細胞分化達高峰，細胞體積達到最大，胞質(zhì)內(nèi)脂滴數(shù)量最多。第3周時進行油紅0染色，可見細胞內(nèi)脂滴被紅染。BMS

7、Cs在向成骨細胞誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)第7天后細胞形態(tài)開始發(fā)生明顯變化，經(jīng)14天誘導(dǎo)后形態(tài)類似成骨細胞，對誘導(dǎo)3周的成骨樣細胞進行堿性磷酸酶染色，可見細胞胞體周圍有深淺不一的淺黑色受染區(qū)。BMSCs的S-100蛋白免疫組化染色為陰性。 2、未交聯(lián)的I型膠原膜呈白色海綿狀，抗撕拉能力差，交聯(lián)后的膠原膜為半透明的無色薄膜，柔韌適度，富有彈性，具有一定的抗撕拉能力。在24孔板單孔大小的膠原膜上于第1天種植2×106個BMSCs，以BMSCs完

8、全培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后第2天種植2×105個黑色素細胞，以黑色素細胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)可以構(gòu)建出含有混和細胞的組織工程皮膚；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)黑色素細胞及BMSCs在膠原膜上可以良好生長；S-100蛋白的免疫組化可以觀察到種植在組織工程皮膚上的黑色素細胞呈陽性反應(yīng)。 3、術(shù)后第2周各組皮膚創(chuàng)面開始愈合。大體標(biāo)本觀察兩組含有BMSCs的組織工程皮膚的愈合情況要好于含有單純黑色素細胞組織工程皮膚組，創(chuàng)面小，血痂少；HE染色可以看到前兩組的表皮

9、結(jié)構(gòu)厚，細胞排列更為有序；S-100蛋白免疫組化染色可以看到含有黑色素細胞的兩組組織工程皮膚為陽性反應(yīng)，而含有單純BMSCs的組織工程皮膚組為陰性反應(yīng)。透射電鏡觀察可以看到在成活的組織工程皮膚中含有黑色素細胞，并且與基底膜之間形成半橋粒連接；表皮細胞排列整齊，胞質(zhì)含有大量張力細絲；相鄰的表皮細胞之間形成橋粒連接。在術(shù)后第1、2周時可以看到DAPI標(biāo)記的人黑色素細胞。 研究結(jié)論： 1、通過低濃度胰酶消化培養(yǎng)法可以從人包皮組

10、織中獲得大量高純度生長狀態(tài)良好的黑色素細胞；從骨髓中分離得到的BMSCs遺傳性狀穩(wěn)定，具有多向分化潛能，二者可以作為構(gòu)建組織工程皮膚的種子細胞來源；S-100蛋白免疫組化反應(yīng)可以用來鑒別黑色素細胞和BMSCs混和生長的細胞群中的黑色素細胞。 2、BMSCs完全培養(yǎng)基和黑色素細胞完全培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)的前3天內(nèi)可以彼此互相替代；以105個/cm2級別的黑色素細胞和106個/cm2級別的BMSCs比例混合與I型膠原膜復(fù)合可以在體外構(gòu)建