基于瓊脂擴(kuò)散法建立檢測尿液和血清抗氧化能力方法的臨床應(yīng)用及機(jī)體抗氧化能力與SIRT1基因突變的關(guān)聯(lián).pdf

1、目的:
　　基于氧化還原滴定反應(yīng)，建立線性好、重復(fù)性好的高錳酸鉀瓊脂法和碘淀粉瓊脂法，以測定尿液和血清中的總抗氧化物質(zhì)。將高錳酸鉀瓊脂法和碘淀粉瓊脂法用于對(duì)ICU患者的血清和尿液中的總抗氧化物質(zhì)含量的檢測，以驗(yàn)證兩法在臨床的可用性。用碘淀粉瓊脂法對(duì)冠心病患者尿液中的總抗氧化物質(zhì)含量及可能的抗氧化機(jī)制進(jìn)行探討。將高錳酸鉀瓊脂法和碘淀粉瓊脂法聯(lián)合應(yīng)用于評(píng)價(jià)非選擇性腫瘤患者尿液和血清中的總抗氧化物質(zhì)含量及可能的抗氧化機(jī)制探討，并繪制了診

2、斷腫瘤疾病的ROC曲線。分析了尿液和血清抗氧化能力與尿干化學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)間的關(guān)系及可能機(jī)制。用兩對(duì)引物-聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR-CTPP)技術(shù)分析健康人群SIRT1基因rs7895833 A＞G序列的多態(tài)性，探討SIRT1基因啟動(dòng)子序列單核苷酸多態(tài)性與機(jī)體抗氧化能力的關(guān)系。
　　方法:
　　1.基于高錳酸鉀氧化還原滴定法建立了高錳酸鉀瓊脂法。將已知濃度的氧化劑高錳酸鉀與瓊脂混合制作高錳酸鉀瓊脂平板，將尿液或者血清加入瓊

3、脂中與氧化劑高錳酸鉀反應(yīng)，24小時(shí)避光隔氧充分反應(yīng)后測量擴(kuò)散環(huán)大小，計(jì)算擴(kuò)散環(huán)面積，評(píng)估尿液或者血清中含有的總抗氧化物質(zhì)的多少。按照NCCLS的EP5-A2文件對(duì)方法的精密度作出評(píng)價(jià)，用線性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。對(duì)30例ICU患者和44例健康人群的血清，利用高錳酸鉀瓊脂法測定總抗氧化物質(zhì)的含量。
　　2.基于碘氧化還原滴定法建立了碘淀粉瓊脂法。將已知濃度的氧化劑碘、指示劑淀粉與瓊脂混合制作碘淀粉瓊脂平板，將尿液或者血清加入瓊脂中與

4、氧化劑碘反應(yīng)，24小時(shí)避光隔氧充分反應(yīng)后測量擴(kuò)散環(huán)大小，計(jì)算擴(kuò)散環(huán)面積，評(píng)估尿液或者血清中含有的總抗氧化物質(zhì)的多少。按照NCCLS的EP5-A2文件對(duì)方法的精密度作出評(píng)價(jià)，用線性實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。對(duì)30例ICU患者和44例健康人群的尿液，利用碘淀粉瓊脂法測定其總抗氧化物質(zhì)的含量。
　　3.利用碘淀粉瓊脂法對(duì)44例冠心病患者和44例健康人群的尿液中總抗氧化物質(zhì)含量進(jìn)行檢測，并探討了尿液中的抗氧化物質(zhì)在冠心病的發(fā)生時(shí)可能的抗氧化機(jī)

5、制。
　　4.使用兩種方法分別對(duì)44例非選擇性腫瘤患者和44例健康人群的尿液和血清中的總抗氧化物質(zhì)含量進(jìn)行測定并探討了可能機(jī)制，根據(jù)尿液和血清在兩種方法中的擴(kuò)散面積建立回歸模型，根據(jù)回歸模型繪制了診斷腫瘤疾病的ROC曲線。
　　5.利用相關(guān)分析和Logistic條件回歸后退法分析了尿液和血清抗氧化能力與尿干化學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)間的關(guān)系及可能機(jī)制。
　　6.用兩對(duì)引物-聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR-CTPP)技術(shù)分析健康人群

6、SIRT1基因rs7895833 A＞G序列的多態(tài)性，探討SIRT1基因啟動(dòng)子序列單核苷酸多態(tài)性與機(jī)體抗氧化能力的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.在高錳酸鉀瓊脂法檢測尿液標(biāo)本的精密度實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)中，高水平尿液樣本的擴(kuò)散面積批內(nèi)、批間和天間變異系數(shù)分別為3.8％、8.7％和10.6％;低水平尿液樣本的擴(kuò)散面積批內(nèi)、批間和天間變異系數(shù)分別為2.6％、9.6％和14.0％。評(píng)價(jià)高錳酸鉀瓊脂法檢測標(biāo)準(zhǔn)還原性物質(zhì)的線性實(shí)驗(yàn)，線性方程中R2為0

7、.994;評(píng)價(jià)高錳酸鉀瓊脂法檢測帶基質(zhì)樣本的線性實(shí)驗(yàn)，線性方程中R2為0.902。在高錳酸鉀瓊脂法檢測血清標(biāo)本的精密度實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)中，高水平血清高水平樣本的擴(kuò)散面積批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為2.9％和12.3％;低水平血清樣本的擴(kuò)散面積批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為3.0％和5.1％。由于在計(jì)算天間方差時(shí)，出現(xiàn)負(fù)值，依據(jù)EP5-A2文件，將天間標(biāo)準(zhǔn)差設(shè)置為0，故未計(jì)算天間變異系數(shù)。評(píng)價(jià)高錳酸鉀瓊脂法檢測標(biāo)準(zhǔn)還原性物質(zhì)的線性實(shí)驗(yàn)，線性方程中R2為0.

8、994;評(píng)價(jià)高錳酸鉀瓊脂法檢測帶基質(zhì)樣本的線性實(shí)驗(yàn)R2為0.987。將高錳酸鉀瓊脂法用于檢測ICU患者血清中總抗氧化物質(zhì)含量時(shí)，ICU患者血清擴(kuò)散面積的中位數(shù)為1.77 cm2，健康人群的為2.01cm2，兩組血清擴(kuò)散面積比較，p值為0.002，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.在碘淀粉瓊脂法檢測尿液標(biāo)本的精密度實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)中，高水平尿液樣本的擴(kuò)散面積批內(nèi)、批間和天間變異系數(shù)分別為5.1％、9.1％和8.1％;低水平尿液樣本的擴(kuò)散面積批內(nèi)、

9、批間和天間變異系數(shù)分別為2.7％、9.5％和8.1％。評(píng)價(jià)碘淀粉瓊脂法檢測標(biāo)準(zhǔn)還原性物質(zhì)的線性實(shí)驗(yàn)，線性方程中R2為0.999;評(píng)價(jià)碘淀粉瓊脂法檢測帶基質(zhì)樣本的線性實(shí)驗(yàn)，線性方程中R2為0.995。在碘淀粉瓊脂法檢測血清標(biāo)本的精密度實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)中，高水平血清樣本的擴(kuò)散面積批內(nèi)、批間和天間變異系數(shù)分別為2.9％、5.4％和7.1％;低水平血清樣本的擴(kuò)散面積批內(nèi)、批間和天間變異系數(shù)分別為3.6％、5.9％和14.9％。評(píng)價(jià)碘淀粉瓊脂法檢測標(biāo)準(zhǔn)還

10、原性物質(zhì)的線性實(shí)驗(yàn)，線性方程中R2為0.999;評(píng)價(jià)碘淀粉瓊脂法檢測帶基質(zhì)樣本的線性實(shí)驗(yàn)R2為0.990。將碘淀粉瓊脂法用于檢測ICU患者尿液中總抗氧化物質(zhì)含量時(shí)，ICU患者尿液擴(kuò)散面積的中位數(shù)為1.38 cm2，健康人群的為1.13 cm2，兩組尿液擴(kuò)散面積比較，p值為0.021，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.將碘淀粉瓊脂法用于冠心病人尿液中總抗氧化物質(zhì)含量的檢測時(shí)，冠心病患者尿液中總抗氧化物質(zhì)擴(kuò)散面積中位數(shù)為0.95 cm2，而

11、健康人群尿液中總抗氧化物質(zhì)擴(kuò)散面積中位數(shù)為1.13 cm2，兩組尿液擴(kuò)散面積比較，p值為0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.將兩法分別用于檢測非選擇性腫瘤患者尿液和血清中的總抗氧化物質(zhì)含量時(shí)，尿液標(biāo)本在高錳酸鉀瓊脂擴(kuò)散中，腫瘤患者擴(kuò)散面積的中位數(shù)為1.83 cm2，健康人群的為1.54 cm2，兩組尿液擴(kuò)散面積比較，p值為0.038，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;尿液標(biāo)本在碘淀粉瓊脂擴(kuò)散中，腫瘤患者擴(kuò)散面積中位數(shù)為1.54 cm2，健康人

12、群的為1.13 cm2，兩組尿液擴(kuò)散面積比較，p值為0.016，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清標(biāo)本在高錳酸鉀瓊脂擴(kuò)散中，腫瘤患者擴(kuò)散面積為2.02±0.46 cm2，健康人群為1.97±0.17 cm2，兩組血清擴(kuò)散面積比較，p值為0.158，尚不能認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;血清標(biāo)本在在碘淀粉瓊脂擴(kuò)散中，腫瘤患者血清擴(kuò)散面積為3.20±0.40cm2，健康人群為2.94±0.46 cm2，兩組血清擴(kuò)散面積比較，p值為0.005，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將尿液

13、和血清標(biāo)本在兩種方法中的擴(kuò)散面積擬合用于診斷腫瘤疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，只有尿液在碘淀粉瓊脂中的擴(kuò)散面積(UI)和血清在碘淀粉瓊脂中的擴(kuò)散面積(SI)進(jìn)入回歸方程，回歸模型為Y=0.850 UI+2.209 SI-7.691，此時(shí)的ROC曲線下面積(AUC)為0.787。
　　5.以Spearman秩相關(guān)分析尿液和血清擴(kuò)散面積與尿干化學(xué)指標(biāo)和血清生化指標(biāo)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)尿液擴(kuò)散面積與尿干化學(xué)中的尿膽原、尿蛋白、尿糖、pH、尿比密、濁度和尿色存

14、在相關(guān)性，其p值分別為0.048、＜0.001、0.005、＜0.001、＜0.001、0.040和＜0.001;與血清生化指標(biāo)中的血糖、尿素、肌酐、白蛋白、球蛋白、膽固醇和甘油三酯存在相關(guān)性，其p值分別0.012、＜0.001、0.017、0.001、0.016、0.043和0.038。血清的擴(kuò)散面積與尿干化學(xué)中的尿膽原和尿液顏色相關(guān)，其p值為0.033和0.017;與血清生化指標(biāo)中的血糖、尿酸、白蛋白、膽固醇和甘油三酯相關(guān)，其p值分

15、別為0.011、0.004、＜0.001、0.041和0.013。Logistic回歸后退法進(jìn)一步分析顯示，尿蛋白、pH、尿色、血清中白蛋白和甘油三酯進(jìn)入與尿液擴(kuò)散面積有關(guān)的回歸模型，其p值分別為＜0.001、＜0.001、＜0.001、0.056和0.080;尿膽原、尿蛋白、pH、白細(xì)胞、尿色、血清尿素、血清尿酸和血清白蛋白進(jìn)入與血清擴(kuò)散面積有關(guān)的回歸模型，其p值分別為0.066、0.025、0.016、0.001、0.017、0.0

16、03、0.005和＜0.001。
　　6.分析機(jī)體抗氧化能力與SIRT1基因多態(tài)性的關(guān)系，在啟動(dòng)序列rs7895833A＞G基因多態(tài)性中，AA基因型占3.1％，AG基因型占43.1％，GG基因型占53.8％，A等位基因占24.6％，G等位基因占75.4％，基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(p=0.067)，血清的抗氧化能力與AG基因型(p=0.009)和GG基因型(p=0.010)均存在相關(guān)性。
　　結(jié)論:

17、
　　1.建立了高錳酸鉀瓊脂法和碘淀粉瓊脂法檢測尿液和血清中總抗氧化物質(zhì)的含量的方法，方法適用于檢測尿液和血清中含有的總抗氧化物質(zhì)含量，在臨床具有應(yīng)用價(jià)值。
　　2.各類疾病發(fā)生時(shí)，機(jī)體有不一樣的抗氧化機(jī)制。在冠心病發(fā)生時(shí)，尿液中抗氧化物質(zhì)可以對(duì)抗氧化損傷;在腫瘤疾病發(fā)生時(shí)，尿液中含有的抗氧化物質(zhì)比血清更能敏感的對(duì)抗氧化損傷，對(duì)尿液中總抗氧化物質(zhì)含量的檢測有助于對(duì)疾病的診斷。
　　3.尿液和血清中抗氧化物質(zhì)發(fā)揮抗氧化作