四種植物提取物抑制Streptococcus mutans LDH活性、清除自由基作用研究.pdf

1、目的：天然植物提取物在口腔疾病防治領(lǐng)域應(yīng)用的研究已引起越來越多的關(guān)注，近十年來我們課題組一直從多角度進(jìn)行有關(guān)檸檬精油(lemon essential oil，LEO)等天然植物提取物的防齲研究；檸檬烯(limonene，LIM)為L(zhǎng)EO的主要成分；橙皮苷(hesperidin，HPN)也是檸檬提取物(Lemon peel extract，LPE)中的成分，在檸檬精油中含量較低；茶多酚(Tea-Polyphenols，TP)是公認(rèn)的一類有

2、防齲功效的天然植物提取物?？谇患膊≈饕譃橛步M織損傷和軟組織損傷兩大類，其中硬組織損傷主要為齲病，變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)中的乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase，LDH)利用碳水化合物代謝產(chǎn)酸，從而引起菌斑內(nèi)局部pH的降低，造成牙釉質(zhì)的局部脫礦，齲損形成；在軟組織疾病研究方面，有大量文獻(xiàn)報(bào)道，口腔組織內(nèi)過多的自由基可引起牙周病的發(fā)生，清除局部增加的氧自由基可促進(jìn)口腔潰瘍愈

3、合，促進(jìn)頜面部損傷創(chuàng)口的愈合。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究TP、HPN、LEO及其主要成分LIM對(duì)變形鏈球菌乳酸脫氫酶活力和產(chǎn)酸的抑制作用；研究其對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrobenzene hydrazine，DPPH·)和羥基自由基(hydroxyl radical,·OH)的清除能力，進(jìn)一步探討檸檬提取物在口腔疾病防治中可能的作用機(jī)制，為今后開發(fā)天然、無毒副作用、新型的生態(tài)口腔疾病防治制劑提供理

4、論依據(jù)。
　　方法
　　1.測(cè)定四種天然植物提取物對(duì)S.mutans LDH活性的影響
　　選取S.mutans UA159為實(shí)驗(yàn)菌株。首先測(cè)定LEO、HPN、LIM、TP對(duì)S.mutans的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)。選取MIC濃度下三個(gè)濃度作為實(shí)驗(yàn)濃度，空白對(duì)照組為不加任何藥物的BHI液體培養(yǎng)基，采用還原性輔酶Ⅰ氧化法測(cè)定四種天然植物提取物對(duì)S.muta

5、ns LDH活性的影響。
　　2.測(cè)定四種天然植物提取物對(duì)S.mutans代謝產(chǎn)酸的影響
　　用FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)測(cè)定用藥前后培養(yǎng)液中pH值的變化（△pH=初始pH值－終末pH值），以檢測(cè)四種天然植物提取物對(duì)S.mutans產(chǎn)酸能力的抑制作用，并對(duì)LDH活性和產(chǎn)酸能力做相關(guān)性分析。
　　3.測(cè)定四種天然植物提取物對(duì)自由基的清除作用
　　選取四種天然植物提取物MIC以下三個(gè)濃度組作為實(shí)驗(yàn)組，采用UV－Vis光譜分

6、析方法，測(cè)定TP、HPN、LEO及其主要成分LIM對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)和羥基自由基(·OH)的清除能力。
　　4.采用SPSS17.0軟件，將數(shù)據(jù)輸入并進(jìn)行分析，各組總體均數(shù)間的比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA)；采用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)對(duì)各樣本組間均數(shù)進(jìn)行兩兩比較；P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果
　　1. LEO、HPN、LIM、TP對(duì)S.muta

7、ns的MIC分別為4.5mg/ml、8mg/ml、23mg/ml、4mg/ml。
　　2. LEO[2.25mg/ml(1/2MIC)~0.563mg/ml(1/8MIC)]、HPN[4mg/ml(1/2MIC)~1mg/ml(1/8MIC)]、LIM[11.5mg/ml(1/2MIC)~2.875mg/ml(1/8MIC)]和TP[2mg/ml(1/2MIC)~0.5mg/ml(1/8MIC)]，對(duì)S.mutans LDH活性和

8、產(chǎn)酸均有抑制作用，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（酶活性：FLEO=105.186，P<0.05；FHPN=34.522，P<0.05；FLIM=31.40，P<0.05；FTP=28.209，P<0.05；產(chǎn)酸：FLEO=162.05，P<0.05；FHPN=24.003，P<0.05；FLIM=73.945，P<0.05；FTP=32.006，P<0.05），并隨實(shí)驗(yàn)溶液濃度升高，作用能力增強(qiáng)；同時(shí)，對(duì)酶活性和產(chǎn)酸的影響具有一定

9、的相關(guān)性，LEO和HPN溶液對(duì)S.mutans的作用呈正相關(guān)(rLEO=0.963～0.994; rHPN=0.893~0.973)，而TP和LIM溶液對(duì)S.mutans的作用無相關(guān)性(rTP=0.999～0.198;rLIM=0.981~0.115)。
　　3.四種天然植物提取物1/2 MIC濃度組，對(duì)其抑制S.mutans培養(yǎng)溶液中LDH活性的能力進(jìn)行比較，依次為：LEO>LIM>TP>HPN，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.34

10、2，P<0.05)；對(duì)其抑制S.mutans培養(yǎng)溶液中產(chǎn)酸的能力進(jìn)行比較，依次為：LEO>LIM>HPN>TP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.744，P<0.05)。
　　4. LEO[2.25mg/ml（1/2MIC）~0.563mg/ml（1/8MIC）]、HPN[4mg/ml（1/2MIC）~1mg/ml（1/8MIC）]、LIM[11.5mg/ml（1/2MIC）~2.875mg/ml（1/8MIC）]和TP[2mg/ml（1

11、/2MIC）~0.5mg/ml（1/8MIC）]，對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)和羥基自由基(·OH)均有清除能力(DPPH·自由基：FLEO=2249.965，P<0.05；FHPN=47.217，P<0.05；FLIM=21.825，P<0.05；FTP=6.246，P<0.05；·OH自由基：F LEO=99.977，P<0.05；FHPN=15.145，P<0.05；FLIM=9.200，P<0.05；FTP=1

12、9.935，P<0.05)，并且隨TP、LEO、HPN及LIM濃度的增加，清除作用加強(qiáng)。
　　5.四種天然植物提取物對(duì)DPPH·自由基的清除能力為：橙皮苷＞檸檬精油＞茶多酚＞檸檬烯（IC50分別為0.097，0.0143，0.0139，0.0024）。對(duì)羥自由基的清除能力為：茶多酚＞檸檬精油＞橙皮苷＞檸檬烯（IC50分別為0.0794，0.0133，0.011，0.0040）。
　　結(jié)論
　　1. LEO、HPN、TP

13、及LIM四種天然植物提取物均能抑制S.mutans的LDH活性和產(chǎn)酸，且均具有濃度依賴性。作用能力相比較，最強(qiáng)的是LEO。LEO和HPN溶液對(duì)S.mutans LDH活性抑制和產(chǎn)酸抑制作用呈正相關(guān)。
　　2. LEO、HPN、TP及LIM四種天然植物提取物均能對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)和羥基自由基(·OH)均有清除能力，且均具有濃度依賴性。清除DPPH·的能力，HPN要明顯優(yōu)于其他三組藥物；清除·OH的能力，T