基于人尿源干細(xì)胞的骨組織工程研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)從成人清潔中段尿中分離尿源干細(xì)胞(human urine-derived stemcells,USCs)，并探究USCs的生物學(xué)特征，通過(guò)增殖速度、表面標(biāo)志物和多向分化潛能比較USCs與脂肪來(lái)源的干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASCs)的生物學(xué)特征;在此基礎(chǔ)上，探究骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bone morphogeneticprotein2)轉(zhuǎn)染對(duì)USCs成骨分化能力的影響:然后，研究USCs在磷酸

2、三鈣(β-TCP)上的生物學(xué)行為，最后，將USCs接種至β-TCP上并移植到大鼠股骨大段骨缺損中，探究USCs/β-TCP復(fù)合物對(duì)大段骨缺損的修復(fù)作用。
　　方法:第一部分:收集健康成人清潔中段尿200 ml，離心洗滌后加入配制的專(zhuān)用培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)USCs。通過(guò)CCK-8和流式細(xì)胞儀檢測(cè)USCs增殖能力和表面標(biāo)志物。加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，探究USCs成骨、成軟骨和成脂肪分化能力。第二部分:體外構(gòu)建含人BMP2基因的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染US

3、Cs，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活力，檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)USCs堿性磷酸酶活性(ALP)，礦鹽沉積和成骨標(biāo)志物表達(dá)的影響，將轉(zhuǎn)染BMP2的USCs移植到裸鼠體內(nèi)分析其異位成骨能力。第三部分:分離并擴(kuò)增USCs，將USCs接種至β-TCP支架上，通過(guò)掃描電鏡，CCK-8和活死細(xì)胞染色檢測(cè)USCs在β-TCP上的粘附、增殖和存活，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7天和14天后，通過(guò)ALP活性和成骨基因表達(dá)檢測(cè)USCs在β-TCP上成骨分化情況。第四部分:將USCs

4、/β-TCP復(fù)合物移植到大鼠6 mm股骨缺損處，在術(shù)后4、8和12周通過(guò)X線，micro-CT以及組織學(xué)染色來(lái)分析骨缺損的愈合情況。
　　結(jié)果:第一部分:5-7 d后在培養(yǎng)板中觀察到細(xì)胞克隆出現(xiàn)，14d后可以達(dá)到90％的融合。CCK-8證實(shí)貼壁細(xì)胞增殖活躍，與ASCs一樣呈現(xiàn)“S”形增殖曲線。流式細(xì)胞儀結(jié)果證實(shí)USCs和ASCs表達(dá)CD29，CD44，CD73，CDg0，不表達(dá)CD31，CD34，CD45，CD133，CD309和

5、HLA-DR。但CD105在ASCs中表達(dá)較高，而在USCs中表達(dá)較低。USCs可以向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。與ASCs具有同樣的多向分化能力。經(jīng)過(guò)體外多次傳代后，USCs仍然顯示正常的核型。第二部分:流式結(jié)果顯示慢病毒轉(zhuǎn)染效率高達(dá)90％，且轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖未受明顯的影響。慢病毒轉(zhuǎn)染BMP2基因到USCs后，BMP2基因表達(dá)和蛋白分泌量明顯增多，BMP2轉(zhuǎn)染組ALP活性和礦鹽沉積明顯高于普通USCs和GFP轉(zhuǎn)染組。同時(shí)BMP2-

6、USCs高表達(dá)成骨相關(guān)的標(biāo)志物:Runx2和OCN，組織學(xué)染色分析顯示BMP2-USCs移植組在裸鼠肌袋中形成大量的新生骨。第三部分:USCs可以在β-TCP支架上粘附、增殖和存活。ALP活性和成骨相關(guān)基因表達(dá)證實(shí)USCs向成骨細(xì)胞分化。第四部分:X線和micro-CT結(jié)果證實(shí)USCs/β-TCP組修復(fù)效果明顯優(yōu)于單純?chǔ)?TCP和空白對(duì)照組。組織學(xué)染色同樣證明USCs/β-TCP組新生骨明顯多于單純?chǔ)?TCP和空白對(duì)照組。熒光顯微鏡顯示

7、USCs/β-TCP組礦鹽沉積速度明顯快于β-TCP和空白對(duì)照組。術(shù)后12周抗人細(xì)胞核抗體證實(shí)USCs在骨缺損部位的存活。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示USCs/β-TCP能明顯的促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。
　　結(jié)論:從成人清潔中段尿液中可以分離得到USCs，USCs具有與ASCs類(lèi)似的生物學(xué)特征。BMP2基因轉(zhuǎn)染有效的促進(jìn)USCs成骨分化。USCs能在β-TCP上粘附，增殖，存活和成骨分化。USCs/β-TCP移植能顯著促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，USCs可做