骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與新型仿生復(fù)合支架用于骨組織工程的研究.pdf

1、第一部分　成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外分離、擴(kuò)增、鑒定及成骨誘導(dǎo)分化體系的建立 1.1 目的 分離、擴(kuò)增、鑒定成人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)，并建立體外成骨誘導(dǎo)分化體系，為組織工程骨的研究奠定基礎(chǔ)。 1.2 方法 取健康的成人骨髓，F(xiàn)icoll-Hypaque密度離心法分離，含10％FCS的L-DMEM培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)，3d后全量換液除去未貼壁細(xì)胞。培養(yǎng)至14～18d細(xì)胞接近融合，接近融合的細(xì)胞用胰酶室溫消

2、化，按1：3比例傳代，含10％FCS的L-DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。取第3～5代貼壁細(xì)胞用10mg／L胰島素，1μmol／L地塞米松，0.5mmol／L 1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)，100mmol／L吲哚美辛的條件定向誘導(dǎo)貼壁細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，對(duì)照組用L-DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀察形態(tài)學(xué)的變化。在誘導(dǎo)的第14d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均用油紅O染色。用10-7mol／L地塞米松，

3、10mmol／L β-甘油磷酸鈉，50μg／ml維生素C(Vitamin C)的條件定向誘導(dǎo)貼壁細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。對(duì)照組用L-DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。觀察形態(tài)學(xué)變化，在誘導(dǎo)的第14d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均用堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色，在誘導(dǎo)的第21d實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均用茜素紅染色。 1.3結(jié)論 1.3.1成功地進(jìn)行了成人骨髓來(lái)源的hMSCs的分離、擴(kuò)增及鑒定。 1.3.2在含地塞

4、米松、β-甘油磷酸鈉、Vitamin C的成骨誘導(dǎo)液的作用下，hMSCs可在體外定向分化為成骨細(xì)胞，其成骨過(guò)程與體內(nèi)成骨細(xì)胞有相似的形態(tài)和生長(zhǎng)特點(diǎn)。 第二部分　人的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞與新型仿生復(fù)合支架體外相互作用的研究 2.1目的 評(píng)價(jià)hMsCs在新型BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架上的粘附，增殖，遷移及成骨分化能力，為進(jìn)一步MSCs與BG-COL-HYA-PS支架體外構(gòu)建組織工程骨及體內(nèi)修復(fù)骨缺損的研究提供依據(jù)。

5、 　　2.2方法　　將消化好的20μlP3hMSCs(3×106／ml)細(xì)胞懸液接種到BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架，及58sBG，BG-COL，BG-COL-HYA對(duì)照組支架表面，加入L-DMEM完全培養(yǎng)液用于檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)，粘附，增殖及遷移；加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液用于檢測(cè)細(xì)胞的分化。 細(xì)胞材料復(fù)合物培養(yǎng)1d，在掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；細(xì)胞材料復(fù)合物培養(yǎng)0天(6h)，3d，7d，14d，21d用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的粘附和

6、增殖；在培養(yǎng)Od(6h)，3d，7d，14d，21d時(shí)，各細(xì)胞支架復(fù)合物用冰凍切片機(jī)切成10μm厚的切片(垂直于材料的細(xì)胞接種表面，穿過(guò)材料的中心)，Hoechst 33344染色20min，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞在材料內(nèi)部的分布；對(duì)于每一張切片，從細(xì)胞接種面到材料中部依次分為5個(gè)100μm遷移距離帶，通過(guò)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)不同時(shí)間點(diǎn)每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞數(shù)，從而對(duì)細(xì)胞的遷移距離進(jìn)行定量評(píng)估。 細(xì)胞支架復(fù)合物在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)14d時(shí)取出，

7、用冰凍切片機(jī)切成10gm厚的切片(垂直于材料的細(xì)胞接種表面，穿過(guò)材料的中心)，加入BCIP／NBT染色液20min，觀察ALP染色結(jié)果；細(xì)胞支架復(fù)合物在成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3d，7d，14d，21d時(shí)，加入A300μl ALP裂解液，超聲裂解，提取蛋白。用Alkaline Phosphatase Assay kit檢測(cè)堿性磷酸酶濃度，用Bio-Rad DC Protein Assaykit檢測(cè)總蛋白濃度，ALP活性計(jì)算為酶濃度與總蛋白濃度之

8、比；成骨誘導(dǎo)后14d，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR分析骨橋蛋白(osteopontin，OPN)，ALP，骨鈣素(osteocalcin，OC)等成骨基因的表達(dá)。 2.3結(jié)論 2.3.1無(wú)機(jī)的58sBG與COL，HYA，PS等有機(jī)成分復(fù)合能明顯提高h(yuǎn)MSCs的黏附、生長(zhǎng)、遷移及分化為骨組織的能力。 2.3.2仿生BG-COL-HYA-PS復(fù)合支架與hMSCs在體外有良好的相互作用。 第三部分　Hr

9、GFP基因示蹤rMSCs與復(fù)合支架體外構(gòu)建組織工程骨的研究 3.1目的 用綠色熒光蛋白(humanized renillar green fluorescent proteirt，hrGFP)標(biāo)記大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)，與BG-COL-HYA-PS支架復(fù)合培養(yǎng)體外構(gòu)建組織工程骨，示蹤標(biāo)記細(xì)胞在工程化骨體外構(gòu)建的作用。 3.2方法 分離四周齡SD鼠股骨及脛骨近端，沖洗骨髓后，用直接貼壁法獲得原代r

10、MSCs，擴(kuò)增至第3代用于基因轉(zhuǎn)染。 HrGFP質(zhì)粒經(jīng)XL-GOLD菌轉(zhuǎn)化后堿法提取質(zhì)粒DNA，用293FT細(xì)胞包裝含hrGFP的Lentiviral Vectors后，獲得病毒上清轉(zhuǎn)染rMSCs。 將hrGFP標(biāo)記的rMSCs(3×106／ml)接種到BG-COL-HYA-PS支架表面，加入L-DMEM完全培養(yǎng)液或成骨細(xì)胞誘導(dǎo)液。分別在接種6h，7d，14d熒光倒置顯微鏡直接觀察細(xì)胞的形態(tài)，粘附及增殖；在培養(yǎng)Od(6h

11、)，7d，14d時(shí)，細(xì)胞支架復(fù)合物被取出，用冰凍切片機(jī)將復(fù)合物切成10gm厚的切片(垂直于材料的細(xì)胞接種表面，穿過(guò)材料的中心)，熒光倒置顯微鏡觀察不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞在材料內(nèi)部的分布；成骨誘導(dǎo)后14d，細(xì)胞材料復(fù)合物行冰凍切片，熒光免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Ⅰ型膠原(COL Ⅰ)的表達(dá)。 　　　第四部分　HrGFP-rMSCs與復(fù)合支架修復(fù)大鼠股骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究 4.1目的 用hrGFP-rMSCs與BG-COL-HYA-PS

12、復(fù)合支架在體外構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)大鼠股骨骨缺損，以探討其修復(fù)骨缺損的可能性，同時(shí)示蹤體內(nèi)移植后rMSCs的作用及轉(zhuǎn)歸。 4.2方法 將hrGFP-rMSCs，分別與58SBG，BG-COL,BG-COLHYA, BG-COL-HYA-PS支架復(fù)合接種(分別為B／MSC組，BC／MSC組，BCH／MSC組，BCHP／MSC組)，體外成骨誘導(dǎo)14d。另外設(shè)置BG-COL-HYA-PS支架未復(fù)合細(xì)胞組(BCHP組)，相同條件

13、下誘導(dǎo)14d作為對(duì)照。 制作成年SD鼠雙側(cè)股骨骨缺損模型：股骨中下段1／3，寬3.5mm，長(zhǎng)4.5mm，深度達(dá)到骨髓的缺損。缺損處或放入支架細(xì)胞復(fù)合物，或僅放BG-COL-HYA-PS支架，或?yàn)榭瞻讓?duì)照(Empty組)。觀察術(shù)后局部及全身反應(yīng)。 術(shù)后3d，3周，6周，各組動(dòng)物行雙后肢側(cè)位X線檢查；各時(shí)間點(diǎn)動(dòng)物處死后即刻取出雙側(cè)股骨，移植物及周?chē)M織石蠟切片行HE染色。顯微鏡下觀察移植物的組織相容性及新骨形成情況。圖片輸入

14、圖文處理軟件Image Pro Plus 5.1進(jìn)行處理，計(jì)算新骨牛成面積百分比；3周行石蠟切片Ⅰ型膠原免疫組化染色；術(shù)后6周，分離獲取整根股骨，另取相同月齡SD鼠正常股骨作為正常對(duì)照，行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)檢測(cè)標(biāo)本的彎曲剛度(N／mm)。 術(shù)后3周將含細(xì)胞材料復(fù)合物的股骨取出，體視熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的分布；細(xì)胞材料復(fù)合物行冰凍切片，倒置熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的存活情況。 4.3小結(jié) 4.3.1 BG-COL-HYA