體內(nèi)灌注誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、由創(chuàng)傷、感染、腫瘤、燒傷等引起的大塊骨缺損是臨床治療的棘手問(wèn)題，采用傳統(tǒng)的自體骨或同種異體骨移植及生物材料填充，由于存在種種弊端，治療效果均不理想，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用。組織工程技術(shù)的興起為解決這一難題帶來(lái)了希望，成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。然而，大塊組織工程骨血管化以及生長(zhǎng)因子持續(xù)穩(wěn)定的釋放等關(guān)鍵性技術(shù)難題至今未找到理想的解決辦法。顯然，采用常規(guī)的思路對(duì)大塊骨缺損進(jìn)行修復(fù)遇到了巨大的挑戰(zhàn)。為了找到一條可供臨床用來(lái)修復(fù)大塊骨缺損的組織工程之路，

2、本研究力圖探索出一條基于整體論和還原論相結(jié)合的骨組織工程研究的創(chuàng)新之路，并率先建立近同構(gòu)模型——體內(nèi)灌注誘導(dǎo)成骨微環(huán)境系統(tǒng)?；谶@種認(rèn)識(shí)，開(kāi)展了以下一系列研究： 第1章山羊骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng) 目的：將來(lái)源于山羊的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)，在特定的條件下定向誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，觀察其生物學(xué)特性，探討其作為骨組織工程種子細(xì)胞的可行性和應(yīng)用價(jià)值。 方法：抽取健康山羊骨髓采用全骨髓法進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，傳代后改用含地塞

3、米松(10-8mol/L)，β-甘油磷酸鈉(10mmol/L)和維生C(50mg/L)的條件培養(yǎng)基促使其向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化。在相差顯微鏡、HE染色、光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(MTT法)，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞表面特征鑒定，Gomori鈣鉆法進(jìn)行ALP染色、Von Kossa法進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ALP含量變化。 結(jié)果：原代和傳代培養(yǎng)的細(xì)胞具有活躍的增殖能力。誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，生化指標(biāo)

4、穩(wěn)定，光鏡下表現(xiàn)出與典型的成骨細(xì)胞相似的形態(tài)特征。流式細(xì)胞術(shù)證明BMSC細(xì)胞膜抗原CD29，CD44，CD105表達(dá)陽(yáng)性，而CD14，CD34和HLA-DR表達(dá)陰性，ALP及鈣結(jié)節(jié)染色等均為強(qiáng)陽(yáng)性；ALP活性明顯增強(qiáng)。 結(jié)論：山羊BMSC取材安全方便，在特定條件誘導(dǎo)下，可定向誘導(dǎo)分化為具有典型形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和功能的成骨細(xì)胞，山羊BMSC可作為理想的骨組織工程種子細(xì)胞來(lái)源。 第2章rhBMP-2及rhbFGF對(duì)山羊骨髓基質(zhì)干細(xì)

5、胞增殖的效應(yīng) 目的：檢測(cè)hBMP-2和hbFGF單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)山羊骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)增殖的效應(yīng)。 方法：采用MTT法檢測(cè)單獨(dú)及聯(lián)合施加rhBMP-2和rhbFGF后，BMSC在第1，3，5，7及10天增殖的狀況，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：rhBMP-2和hbFGF均能顯著地促進(jìn)BMSC的增殖，并呈劑量依賴性。兩種生長(zhǎng)因子聯(lián)合作用的效應(yīng)高于單獨(dú)作用的效應(yīng)。 結(jié)論：rhBMP-2和hbFGF具有協(xié)同

6、促進(jìn)山羊BMSC增殖的效應(yīng)。 第3章rhBMP-2及rhbFGF對(duì)山羊骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化的效應(yīng) 目的：檢測(cè)rhBMP-2和rhbFGF單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)山羊BMSC的分化效應(yīng)。 方法：采用堿性磷酸酶(ALP)檢測(cè)試劑盒及考馬斯亮蘭測(cè)定法檢測(cè)單獨(dú)及聯(lián)合施加rhBMP-2和rhbFGF后，BMSC在第2，5，7及10天時(shí)的ALP活性及蛋白質(zhì)含量水平以反映對(duì)細(xì)胞分化作用的影響，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：rhBMP

7、-2能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)明顯促進(jìn)細(xì)胞ALP活性及蛋白質(zhì)含量，而rhbFGF則起到抑制作用，且均呈劑量依賴性。rhBMP-2單獨(dú)作用與兩種生長(zhǎng)因子聯(lián)合作用的效應(yīng)相近，均高于hbFGF單獨(dú)作用的效應(yīng)。 結(jié)論：rhBMP-2和hbFGF聯(lián)合應(yīng)用與rhBMP-2單獨(dú)使用均能夠顯著地促進(jìn)山羊BMSC的分化效應(yīng)。 第4章增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 目的：探討以脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒作為骨組織工程

8、種子細(xì)胞示蹤劑的可行性。 方法：選取12月齡中國(guó)青山羊2只作為BMSC供體。將已轉(zhuǎn)染pEGFP—N2的大腸桿菌109菌種，進(jìn)行質(zhì)粒提取并經(jīng)Ava Ⅱ酶切鑒定。脂質(zhì)體(lipofectamine 2000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染羊BMSC細(xì)胞。分別于轉(zhuǎn)染24h、6月后計(jì)算熒光的轉(zhuǎn)染效率。以未標(biāo)記的同期細(xì)胞作對(duì)照。 結(jié)果：質(zhì)粒經(jīng)酶切后電泳，可見(jiàn)三條帶，分別為445bp，1938bp，2354bp，確定所提質(zhì)粒為pEGFP—N2。轉(zhuǎn)染24h

9、后綠色熒光表達(dá)率35％；經(jīng)G418篩選，轉(zhuǎn)染6個(gè)月后綠色熒光表達(dá)率75％，同時(shí)對(duì)照組未觀察到綠色熒光。 結(jié)論：脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染的。pEGFP—N2標(biāo)記BMSC，是一種理想的標(biāo)記方法。 第5章增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒標(biāo)記技術(shù)示蹤組織工程化骨形成 目的：探討以脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒作為骨組織工程種子細(xì)胞示蹤組織工程化骨形成的可行性。 方法：將標(biāo)記與未標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后，檢測(cè)堿性磷酸酶

10、(ALP)活性和四環(huán)素鈣結(jié)節(jié)染色，以未標(biāo)記的同期細(xì)胞作對(duì)照。將標(biāo)記細(xì)胞接種于珊瑚支架，形成BMSC-珊瑚復(fù)合物，分別于體外培養(yǎng)4d、7d、14d后進(jìn)行電鏡掃描觀察。將體外培養(yǎng)7d的BMSC-珊瑚復(fù)合物移植于裸鼠皮下，8周后取出，熒光顯微鏡下進(jìn)行示蹤觀察，HE染色觀察組織結(jié)構(gòu)。以未標(biāo)記的BMSC-珊瑚復(fù)合物、單純珊瑚作對(duì)照。 結(jié)果：與對(duì)照組相比，標(biāo)記細(xì)胞堿性磷酸酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均具有鈣結(jié)節(jié)形成能力。標(biāo)記細(xì)胞與珊瑚材料貼附生

11、長(zhǎng)良好，并分泌膠原纖維及鈣鹽結(jié)晶樣基質(zhì)。組織學(xué)示新生骨樣組織圍繞材料孔隙生成；新生組織細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光清晰表達(dá)，同時(shí)對(duì)照組未觀察到綠色熒光。 結(jié)論：脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染的pEGFP-N2標(biāo)記BMSC，可用于裸鼠體內(nèi)示蹤，是一種理想的組織工程化骨組織的示蹤方法。 第6章山羊脛骨大節(jié)段骨缺損模型的制備 目的：為骨組織工程的研究提供理想的動(dòng)物模型。 方法：取9只青山羊隨機(jī)分3組，制備單側(cè)脛骨25mm的骨膜與骨缺損，

12、重建鋼板內(nèi)固定，術(shù)后放射學(xué)檢查、組織學(xué)方法評(píng)價(jià)骨缺損自行修復(fù)情況。 結(jié)果：術(shù)后所有動(dòng)物骨缺損處x線片Lane評(píng)分均為0分，組織學(xué)顯示無(wú)骨組織長(zhǎng)人。 結(jié)論：山羊脛骨適于制備骨缺損和重建鋼板內(nèi)固定模型，其25mm大段骨缺損模型是研究組織工程骨較為理想的動(dòng)物模型。 第7章近同構(gòu)模型修復(fù)山羊脛骨大段骨缺損的初步研究 目的：探索骨組織工程近同構(gòu)模型修復(fù)羊脛骨干骨缺損的可行性。 方法：體外擴(kuò)增自體骨髓基質(zhì)干細(xì)

13、胞，與珊瑚支架材料復(fù)合，植入山羊脛骨缺損處，同時(shí)通過(guò)便攜式微量泵聯(lián)合皮下植入式給藥裝置，建立近同構(gòu)模型-可調(diào)控的體內(nèi)灌注誘導(dǎo)成骨微環(huán)境系統(tǒng)，定時(shí)注入DMEM培養(yǎng)液、細(xì)胞因子rhbFGF和rhBMP-2。 結(jié)果：術(shù)后8W觀察結(jié)果：術(shù)后8W組織切片HE染色觀察到近同構(gòu)模型組骨組織形成；對(duì)照組僅見(jiàn)纖維組織長(zhǎng)入。x線觀察，術(shù)后8W近同構(gòu)模型組織工程骨周圍形成骨痂，并與脛骨缺損端融合；對(duì)照組術(shù)后8W時(shí)支架材料部分降解、吸收。 結(jié)論