小膠質(zhì)細胞在單純皰疹病毒性腦炎中作用及機制研究.pdf

1、第一部分 小鼠單純皰疹病毒性腦炎主要免疫反應(yīng)特征研究 目的：了解單純皰疹病毒性腦炎(herpessimplexvirusencephalitis，HSE)模型小鼠在單純皰疹病毒Ⅰ型(herpessimplexvirustypeⅠ，HSV1)感染后免疫應(yīng)答在感應(yīng)階段，增生、分化階段以及效應(yīng)階段的主要免疫反應(yīng)特性，為進一步研究HSE免疫機制及探討有效治療HSE的免疫干預(yù)措施打下基礎(chǔ)。 方法：Balb/c小鼠顱內(nèi)直接注

2、入HSV1病毒制造HSE模型，腦組織病理切片HE染色觀察病理形態(tài)變化，流式細胞術(shù)檢測小膠質(zhì)細胞表面CD11b、CD40、MHCⅠ、MHCⅡ抗原表達，RT-PCR檢測小鼠腦內(nèi)細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、iNOS)mRNA表達，SPSS10.0軟件t檢驗處理實驗結(jié)果。 結(jié)果：成功制造HSE小鼠模型，計算HSV1病毒半數(shù)致死量(LD50)為10-5/0.1ml，HSE小鼠腦組織片狀壞死出血，部分神經(jīng)細胞變性，

3、間質(zhì)水腫。HSE小鼠較正常對照小鼠表達CD11b、CD40、MHCⅠ、MHCⅡ抗原明顯增加，MHCⅡ抗原增加較MHCⅠ明顯，TH1(IL-2、TNF-α)，TH2型細胞因子(IL-4、IL-10、)mRNA及iNOSmRNA均較正常對照小鼠顯著高表達(P＜0.05)。 結(jié)論：小膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)重要的抗原提呈細胞(APC)，在HSV1感染后被大量激活、增殖，細胞表面MHC抗原表達增加，發(fā)揮抗原提呈作用，CD40表達增加，有助于淋巴

4、細胞通過血腦屏障和活化，并進一步激活小膠質(zhì)細胞，分泌大量細胞因子，TH1及TH2型細胞因子反應(yīng)在HSE中均起重要作用，并相互協(xié)調(diào)和制約，過氧化反應(yīng)也是HSE的一個重要方面。 第二部分 單純皰疹病毒性腦炎免疫炎性機制研究 目的：以小膠質(zhì)細胞系BV2作為小鼠單純皰疹病毒性腦炎的替代研究對象，了解小膠質(zhì)細胞激活并分泌細胞因子的刺激信號，及細胞因子分泌的細胞內(nèi)信號途徑。 方法：MTT選擇合適的細胞上藥物稀釋濃度，

5、RT-PCR法檢查細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、iNOS)mRNA含量。小鼠顱內(nèi)注射HSV1(10-3/0.1ml)制造小鼠單純皰疹病毒性腦炎(HSE)模型，與接種HSV1病毒(10-2/0.1ml)的小膠質(zhì)細胞系BV2細胞比較接種病毒前后以及用藥前后細胞表面抗原表達及細胞因子mRNA含量改變。Westernblot檢測HSV1感染前后細胞JNKMAPK表達情況，及RT-PCR法檢測ERKMAPK和P38MAPK

6、的抑制劑作用前后細胞因子表達變化及預(yù)后改變。 結(jié)果：BV2細胞具有和Balb/c小鼠腦組織相似的免疫反應(yīng)特性。JNKMAPK在病毒感染后激活，ERKMAPK和P38MAPK的抑制劑PD98059和SB203580均可改善BV2細胞在HSV1感染后的生存率，并可減少TNFmRNA表達；阿司匹林和地塞米松均可減少iNOSmRNA表達。 結(jié)論：BV2細胞可作為小鼠單純皰疹病毒性腦炎的替代研究對象。3條MAPK的主要途徑(JNK

7、，ERK和P38MAPK)在HSE的免疫反應(yīng)中均發(fā)揮作用，ERK和P38MAPK參與HSV1感染后細胞TNFmRNA表達，TNF的表達認為與病毒感染造成細胞死亡有關(guān)。阿司匹林和地塞米松可能具有減少組織過氧化損傷的潛在神經(jīng)保護作用。 第三部分 臨床用藥對單純皰疹病毒性腦炎療效研究 目的：了解幾種臨床常用藥物對HSE預(yù)后及細胞因子分泌的影響。 方法：小鼠顱內(nèi)注射HSV1(10-3/0.1ml)制造小鼠單純皰疹

8、病毒性腦炎(HSE)模型，BV2細胞直接接種病毒作為細胞模型，根據(jù)MTT結(jié)果選用合適的細胞藥物濃度及了解細胞生存率，RT-PCR法檢測小鼠腦內(nèi)細胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、iNOS)mRNA表達，流式細胞術(shù)檢測小膠質(zhì)細胞表面CD11b、CD40、MHCⅠ、MHCⅡ抗原表達，比較在病毒感染后和幾種藥物作用后小鼠腦組織和BV2細胞生存率、免疫抗原表達和細胞因子表達差異。 結(jié)果：黃芪、干擾素和腦多肽可顯著改善B

9、V2細胞和模型小鼠在HSV1感染后的生存率，同時各種細胞因子表達降低(TH1/TH型細胞因子)；阿司匹林、菲克維茲和地塞米松不能改善HSV1感染后的生存率，各種細胞因子分泌仍明顯偏高，以地塞米松明顯；藥物作用后腦組織免疫抗原CD11b、CD40、MHCⅠ、MHCⅡ變化各異。 結(jié)論：HSV1感染的初期，提高機體抗病毒免疫能力是治療的主要方向，具有免疫抑制的藥物如阿司匹林、地塞米松由于不能抑制病毒復(fù)制反而造成晚期的細胞因子表達顯著增

10、高，免疫損傷更嚴重，應(yīng)避免使用；在HSV1感染晚期病毒復(fù)制控制的情況下，可適當(dāng)選用具有免疫抑制作用的藥物。不同神經(jīng)營養(yǎng)劑的免疫調(diào)節(jié)作用不同。 第四部分 單純皰疹病毒性腦炎治療中的預(yù)后評估及用藥指導(dǎo) 目的：找到可通過檢測的細胞因子指導(dǎo)HSE感染后的預(yù)后評估及用藥方案制定的有效工具。 方法：RT-PCR方法檢測在多種實驗藥物及條件下BV2細胞表達細胞因子mRNA含量，MTT檢測細胞存活率。將得到的以上數(shù)據(jù)進行

11、相關(guān)及回歸分析以得到一元線性回歸方程，通過此方程得到BV2細胞的預(yù)后估計值。以2nsoftEditor神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模工具軟件作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)軟件工具，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通過前38組訓(xùn)練集進行訓(xùn)練后，將剩下的23組數(shù)據(jù)作為盲法測試集，代入已經(jīng)訓(xùn)練好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，得到相應(yīng)的預(yù)后估計值。將以上2種方法得到的預(yù)后分析結(jié)果與實際生存率比較，以計算值與實測值之間誤差在15％為標準，15％以內(nèi)為符合，＞15％為不符。了解2種不同方法對HSE感染預(yù)后分析的符合率。

12、 結(jié)果：對61組數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析，得到相關(guān)系數(shù)，同時作實際細胞生存率與各細胞因子關(guān)系散點圖，發(fā)現(xiàn)與生存率相關(guān)性最好的參數(shù)是TNF-α，IL-23，IL-4，而其中以TNF-α和IL-23較優(yōu)。但它們之間的關(guān)系也并非純粹的線性關(guān)系，或多或少存在一定的非線性關(guān)系?；貧w分析得到的一元線性回歸方程為SR=0.184+0.043×(IL-2)-0.013×(IL-4)-0.016×(IL-10)-0.022×P19-0.018×TNF-0.1

13、9×iNOS。對BV2細胞預(yù)后估計值與實際值比較符合率為19％。以61組數(shù)據(jù)中的38組數(shù)據(jù)作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓(xùn)練集對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進行訓(xùn)練，將剩下的23組數(shù)據(jù)作為盲法測試集，代入已經(jīng)訓(xùn)練好的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其預(yù)后估計值與實際值比較符合率為75％，高于回歸分析。 結(jié)論：經(jīng)過訓(xùn)練的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可較準確預(yù)測生存率，可有效分析細胞因子分泌之間的非線性復(fù)雜關(guān)系，將成為臨床指導(dǎo)評估HSE預(yù)后并進行用藥方案制定的有效工具。傳統(tǒng)的回歸分析適合于低維變量和變量線