絨山羊BAC文庫的構(gòu)建與鑒定以及絨毛生長發(fā)育相關(guān)基因的篩選.pdf

1、絨山羊是我國珍貴的絨肉兼用品種，是不可多得的珍貴遺傳資源，為了研究絨山羊絨毛生長發(fā)育和周期性變化的分子機制，本文構(gòu)建了內(nèi)蒙古絨山羊基因組的BAC文庫，為絨毛生長發(fā)育的相關(guān)基因的研究、基因組物理圖譜完善及BAC重疊群的構(gòu)建打下了基礎(chǔ)。隨后，本文對BAC文庫進行了保存。之后又建立了高效的PCR篩選系統(tǒng)，最后對絨山羊絨毛生長發(fā)育的相關(guān)基因進行了篩選，獲得了MTNR1a、KAP8.1、BMP4、FGF5和IGFBP5等與絨山羊絨毛生長發(fā)育相關(guān)的

2、基因的BAC克隆，為將來定位和克隆絨毛生長相關(guān)基因打下了基礎(chǔ)，也為進一步研究絨山羊絨毛生長的分子機制打下了基礎(chǔ)。BAC由于容量大、轉(zhuǎn)化效率高、嵌合體少、易操作易回收、在宿主細胞中插入片段穩(wěn)定性好等特點而成為真核細胞生物核基因組大片段插入文庫制備的良好載體。BAC文庫不僅可以應(yīng)用于目的基因的獲得，還可應(yīng)用于物理圖譜的構(gòu)建、基因功能結(jié)構(gòu)和表達的研究，定位克隆，長距離DNA測序和錨定、鑒定假定的順式調(diào)節(jié)元件、比較基因組學(xué)研究以及轉(zhuǎn)基因研究等。

3、本試驗從雄性阿爾巴斯絨山羊靜脈血中提取白細胞，然后將自細胞包埋進低熔點瓊脂糖凝膠中，通過HindⅢ部分酶切基因組后，通過CHEF凝膠電泳技術(shù)對大片段DNA選行兩次分離，使片段大小集中。之后通過電洗脫方法回收150～400kb范圍的片段。洗脫回收的大片段DNA和BAC載體按摩爾比1：3的比例連接之后，通過點透析對連接產(chǎn)物進行脫鹽處理，處理后的連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH10B。經(jīng)過復(fù)蘇之后將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含有氯霉素、IP

4、TG、X—gal的LB平板培養(yǎng)基上，挑選白色克隆構(gòu)建文庫。本研究所構(gòu)建構(gòu)建的阿爾巴斯絨山羊的BAC文庫，結(jié)果如下： 1.該文庫含有的克隆數(shù)為276480個，分為36個超級池，每個超級池由20塊384孔板組成； 2.隨機挑選的1132個克隆鑒定插入片段大小，估計文庫的平均插入為128kb，其中空克隆比例為0.53％；文庫中77％的克隆插入大于100kb，有部分克隆甚至大于300kb，文庫片段大小比較集中，這樣大小的插入可以

5、滿足所有試驗對于片段大小的要求。 3.以基因組大小為3*109計，文庫的基因組覆蓋率為11.8倍，預(yù)計從文庫中篩選到單拷貝基因的機率為99.99％。 4.整個文庫以兩步—4D的結(jié)構(gòu)保存，并分別提取行池、列池、板池的DNA。 5.建立了高效快速的PCR篩選系統(tǒng)。用20個微衛(wèi)星標(biāo)記和5個功能基因?qū)φ麄€文庫進行PCR篩選，所有這些標(biāo)記和基因都得到了陽性克隆，克隆數(shù)從3到19不等，得到的平均陽性克隆數(shù)為11.3。說明文庫