柔嫩艾美耳球蟲表面抗原EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22的免疫保護(hù)效果研究.pdf

1、雞球蟲病是由一種或多種艾美爾球蟲感染雞腸道細(xì)胞而引起的一類原蟲疾病。艾美爾球蟲的生活史極其復(fù)雜，其不僅會掠奪腸道中的營養(yǎng)而且會對腸道細(xì)胞造成不同程度的損傷。當(dāng)前，雞球蟲病防控仍以藥物為主，但長時(shí)間的使用藥物使得耐藥蟲株不斷出現(xiàn)，因此，球蟲耐藥性問題越演越烈。多年來，研究者們試圖通過其他途徑來解決這一問題，主要包括優(yōu)化使用抗球蟲藥物、新型抗球蟲藥物的篩選以及制備新型抗球蟲疫苗。雖然球蟲藥物篩選和新型抗球蟲疫苗制作的方法早已報(bào)道，但球蟲體外

2、培養(yǎng)技術(shù)仍沒有完全建立和蟲株之間的交叉保護(hù)力較低導(dǎo)致抗球蟲藥物篩選和抗球蟲疫苗研發(fā)進(jìn)展緩慢。
　　因此，本研究從找尋理想保護(hù)性抗原的角度出發(fā)，克隆了E.tenella在入侵和生長發(fā)育中扮演重要作用的表面抗原家族基因EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22，將3個(gè)基因分別和共同插入到原核表達(dá)載體pET28a和真核表達(dá)載體pEGFP-N1之中。在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)，旨在評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物免疫重組蛋白或重組質(zhì)粒后抗E.tenella

3、感染的保護(hù)效果。研究主要包括以下幾個(gè)方面:
　　(1)E.tenella野生株的分離和遺傳多態(tài)性分析
　　從湖北省分離獲得的8個(gè)地區(qū)雞球蟲卵囊孢子化后接種雞，從其盲腸中收集球蟲卵囊，通過形態(tài)學(xué)和ITS1鑒定方法獲取了21個(gè)E.tenella野生株。ITS1序列進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)各地區(qū)E.tenella野生株高度保守，ITS1序列的同源比率從92.7％至100％不等。地理分布的4個(gè)地區(qū)蟲株ITS1序列與其他國家的原蟲進(jìn)化分析表明野生

4、株同樣與其他國家的蟲株具有保守性。市區(qū)分布的9個(gè)區(qū)域蟲株RAPD分析表明所分離的蟲株遺傳特點(diǎn)呈局部地區(qū)關(guān)聯(lián)性和跨地域交叉關(guān)聯(lián)性。
　　(2)E.tenalla表面抗原基因EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22克隆及分析
　　從分離的E.tenalla隨州1株的cDNA中成功地?cái)U(kuò)增到了3個(gè)基因的全長序列，與E.tenalla毫頓株的序列比對結(jié)果表明三者與豪頓株均具有100％的序列同源性。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)抗原氨基酸序

5、列的N末端含有信號肽和C末端含有GPI錨定結(jié)構(gòu)域，且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的親水性較低。
　　(3)EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622的原核表達(dá)
　　分別從3個(gè)基因全長序列中擴(kuò)增了去信號肽和GPI錨定結(jié)構(gòu)域的截短序列，將單個(gè)基因或3個(gè)基因的截短序列構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET28a中。在28℃環(huán)境下誘導(dǎo)10h表達(dá)了重組蛋白EtSAG4、EtSAG16、EtSAG41622，在37℃環(huán)境下誘導(dǎo)5h表達(dá)了重組蛋

6、白EtSAG22。Western blot結(jié)果顯示4個(gè)重組蛋白能與His標(biāo)簽抗體和感染了E.tenella15天雞的血清產(chǎn)生反應(yīng)，結(jié)果證明這4個(gè)重組蛋白成功表達(dá)。
　　(4)EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622的真核表達(dá)
　　將3個(gè)基因去信號肽和GPI錨定結(jié)構(gòu)域的截短序列分別或共同構(gòu)建到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將4個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了

7、重組質(zhì)粒的細(xì)胞均能發(fā)出綠熒光，但轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1的細(xì)胞也能發(fā)出綠熒光，無法完全證明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。RT-PCR的結(jié)果顯示以轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞cDNA為模板可擴(kuò)增出4個(gè)插入片段的目的條帶，以轉(zhuǎn)染了pEGFP-N1質(zhì)粒細(xì)胞cDNA為模板和陰性對照卻未能擴(kuò)增出片段;Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞蛋白可與GFP標(biāo)簽抗體產(chǎn)生反應(yīng)，而陰性對照未能與GFP標(biāo)簽抗體產(chǎn)生反應(yīng)，通過RT-PCR和Western bl

8、ot實(shí)驗(yàn)證明了重組質(zhì)粒在293T細(xì)胞中成功表達(dá)。
　　(5)EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622的免疫保護(hù)效果評估
　　本研究對實(shí)驗(yàn)肉雞進(jìn)行了E.tenella感染的免疫保護(hù)效果評估，免疫重組蛋白動物實(shí)驗(yàn)設(shè)10組，免疫重組質(zhì)粒動物實(shí)驗(yàn)設(shè)11組。除對照組外各實(shí)驗(yàn)組動物于14日齡免疫不同劑量(50μg或100μg)的重組原核表達(dá)蛋白或重組真核表達(dá)質(zhì)粒，于21日齡進(jìn)行二免，二免1周后每羽實(shí)驗(yàn)動物經(jīng)口感

9、染孢子化E.tenella卵囊5×104個(gè)（不感染不免疫組除外）。實(shí)驗(yàn)以檢測二免后實(shí)驗(yàn)動物的細(xì)胞因子水平、IgY濃度和統(tǒng)計(jì)抗球蟲指數(shù)相關(guān)數(shù)據(jù)，從而綜合評價(jià)實(shí)驗(yàn)動物的免疫保護(hù)效果。
　　免疫重組蛋白動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:免疫重組蛋白組與感染不免疫組的IFN-γ濃度均呈顯著性差異;免疫重組蛋白EtSAG22(100μg)、EtSAG16(100μg)和EtSAG41622(100μg)劑量組與感染不免疫組的IL-17濃度均呈顯著性差異;免

10、疫重組蛋白EtSAG16(100μg)和EtSAG41622(100μg)劑量組與感染不免疫對照組之間的IgY濃度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有差異性;以上結(jié)果說明免疫不同劑量重組蛋白后均能刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ水平的能力。ACI結(jié)果顯示，3個(gè)免疫重組蛋白實(shí)驗(yàn)組的ACI達(dá)到了160以上，分別是免疫蛋白EtSAG4(100μg)組的163.77，EtSAG16(100μg)組的166.78和EtSAG41622(100μg)組的165.63，說明免疫這3

11、個(gè)劑量蛋白的實(shí)驗(yàn)組具有中度抗E.tenalla感染的能力。
　　免疫重組質(zhì)粒動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:免疫重組質(zhì)粒組與感染不免疫組的IFN-γ和IL-17濃度均呈顯著性差異;免疫重組質(zhì)粒7個(gè)劑量組與感染不免疫組的IgY濃度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異;以上結(jié)果說明免疫不同劑量重組質(zhì)粒后均能刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ和IL-17水平的能力。ACI結(jié)果顯示，6個(gè)免疫重組質(zhì)粒組的ACI達(dá)到了160以上，其中以免疫重組質(zhì)粒EtSAG41622(100μg