雞柔嫩艾美耳球蟲口服DNA疫苗免疫效果及雞IL-2基因佐劑作用的研究.pdf

1、雞球蟲病是危害養(yǎng)雞業(yè)的最重要寄生蟲病之一，其分布廣，感染率高，常發(fā)生在15—50日齡的雛雞，若不能有效控制，其現(xiàn)場發(fā)病率可達50％—70％，死亡率可達20％—30％，嚴重爆發(fā)時其死亡率可高達80％，每年都造成巨大的經(jīng)濟損失。目前，藥物防治是控制球蟲病的主要手段，但隨著耐藥蟲株的普遍產(chǎn)生及綠色食品概念的形成，人們期望用更好的手段取代之。由于球蟲活苗存在一定的缺陷(如價格高、制備繁雜、潛在毒力返強等)，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，制備工藝相對

2、簡單、能大量生產(chǎn)的基因工程疫苗、DNA疫苗應(yīng)運而生。本課題對E.tenella ZJ株TA4抗原基因進行研究，旨在為雞球蟲基因疫苗的研制提供一種候選基因；同時開展IL—2作為基因佐劑在抗球蟲作用和促進核酸疫苗免疫效果的研究，從而為雞球蟲多價或多聯(lián)基因工程疫苗、DNA疫苗的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。
　　 本文探討了改進的雞柔嫩艾美耳球蟲卵囊純化方法及雞胚培養(yǎng)技術(shù)的效果。純種E.tenella ZJ株孢子化卵囊5×104個/只接種15日齡無球

3、蟲感染的雛雞。接種7天后剖殺雞只，取其盲腸，組織搗碎機打碎，用2mg/ml胃蛋白酶40℃下消化2小時，經(jīng)40目、200目銅篩過濾，離心收集卵囊，2.5％重鉻酸鉀中培養(yǎng)48小時，使卵囊孢子化。取孢子化卵囊培養(yǎng)物離心洗滌除去重鉻酸鉀，次氯酸鈉漂浮進一步純化，抗生素處理，組織勻漿器研磨機械脫囊釋出子孢子，經(jīng)計數(shù)后，以4×104個子孢子的量接種雞胚，獲得成功，與傳統(tǒng)方法相比，本方法具有操作簡單、高效的特點，可作為建立雞胚球蟲感染模型的改進方法，

4、同時也為球蟲免疫學(xué)、組織學(xué)、分子生物學(xué)研究等所需大量高純度的卵囊、子孢子等基礎(chǔ)材料提供重要方法。
　　 用上述方法制備高純度E.tenella ZJ株孢子化卵囊提取總RNA，以此為模板進行RT—PCR。按照Brothers發(fā)表的基因序列設(shè)計和合成引物，引物上下游分別加上EcoR I和Xho I酶切位點，以便于插入載體中。與將PCR擴增產(chǎn)物克隆至pMD18—T轉(zhuǎn)化DH5—α感受態(tài)，經(jīng)酶切鑒定獲得陽性重組質(zhì)粒并對其進行測序，命名為p

5、MD18—T—TA4。測序結(jié)果與參考序列比較分析，克隆片段全長1205個核苷酸，含一個開放閱讀框架，從48—698長度為651bp，編碼217個氨基酸，推測分子量為23.11kDa，與參考序列核苷酸同源性為99.1％。
　　 將重組質(zhì)粒pMD18—T—TA4和表達載體pGEX—4T2分別用EcoR I、Xho I酶切后構(gòu)建重組表達載體pGEX—4T2—TA4，并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR鑒定正確后，用I

6、PTG誘導(dǎo)表達。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS—PAGE和Western—blot檢測顯示，TA4基因在大腸桿菌中成功表達；融合蛋白的分子量約為43kDa，以包涵體形式存在；誘導(dǎo)6h的蛋白表達量可達到35.9％，采用抗GST抗體進行Western—blot成功檢測到了該特異性條帶。
　　 以dam和phoP基因雙突變的減毒鼠傷寒沙門氏菌(ZJ111株)為遞呈載體，探討攜帶TA4基因、雞IL—2基因的真核表達質(zhì)粒pcDNA3 DNA疫苗——ZJ

7、111/pcDNA3—TA4和ZJ111/pcDNA3—IL2的抗球蟲感染免疫保護效果。試驗共分10組，即空白對照組、感染對照組、藥物對照組、TA4融合蛋白免疫組、zJ111/pcDNA3108 cfu免疫對照組、ZJ111/pcDNA3—IL2108 cfu免疫組、ZJ111/pcDNA3—TA4108 cfu免疫組、ZJ111/pcDNA3—TA4107 cfu與ZJ111/pcDNA3—IL2108 cfu聯(lián)合免疫組、ZJ111/

8、pcDNA3—TA4108 cfu與ZJ111/pcDNA3—IL2108 cfu聯(lián)合免疫組和ZJ111/pcDNA3—TA4109 cfu與ZJ111/pcDNA3—IL2108 cfu聯(lián)合免疫組。3日齡進行首免，一周后進行二免，二免后一周用E.tenella ZJ株孢子化卵囊攻毒，劑量為每羽3×104個；攻蟲后第8天，所有雞稱重、剖殺、取其盲腸，觀察盲腸病變，對盲腸內(nèi)容物進行卵囊計數(shù)。結(jié)果表明：藥物對照組、融合蛋白免疫組、ZJ111

9、/pcDNA3—TA4108 cfu與ZJ111/pcDNA3—IL2108 cfu聯(lián)合免疫組的保護效果較好，ACI分別為141.8、158.2和142.4，明顯高于其他各組。試驗結(jié)果提示，以減毒沙門氏菌為載體傳遞雞球蟲DNA疫苗對球蟲感染雞有一定的保護效果，但低于融合蛋白免疫組。IL—2在抗球蟲中有一定的免疫佐劑作用。
　　 綜上所述，以減毒沙門氏菌為載體傳遞雞球蟲DNA疫苗ZJ111/pcDNA3—TA4的ZJ111/pcD