雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)免疫調(diào)節(jié)型dna疫苗pcdna4.0mztgfβ,4的研究

1、中 文 摘 要雞柔 嫩艾美耳球蟲(chóng) 免疫調(diào)節(jié)型 D N A疫苗p c n N A 4 . 0 一 M Z 一 T G F 一 p 4 的 研究摘要雞球蟲(chóng)病是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要疾病之一， 傳統(tǒng)的防制辦法 還存在許多問(wèn)題.D N A疫苗是一種新的生物技術(shù)疫苗， 具有可靠的安全性、高 穩(wěn)定性、能 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答等 優(yōu)點(diǎn)。 T G F 一 口 ; 的功能包 括損傷修復(fù)、 促進(jìn)細(xì) 胞分 化和生長(zhǎng)，在雞球蟲(chóng) 保護(hù)性免疫中 可以下調(diào)宿

2、主的免疫和炎 性反應(yīng)， 能刺激 腸私膜內(nèi) 皮在損傷后的修復(fù)。 M Z S 一 7 是兀 I e n el a 第 二代裂殖子表面杭原基因， 其重組蛋白 對(duì)j { i m 。 、l e l 二 l a經(jīng)口 感染 雛雞 能 產(chǎn) 生 邵分 保護(hù) 力 。 本 研 究 將 雞T G F 一 口 4 基因 單 獨(dú) 克 隆 入p v Ax l 。 或與M Z S 一 7 基因 融 合 克 隆 入p c DN A 4. o b制 備 免 及 調(diào)節(jié) 型

3、核酸 疫苗 、 并 用 構(gòu) 建 的 核 酸 役苗免疚動(dòng)物，檢測(cè)對(duì)忍t e 、 l a 攻蟲(chóng) 的保護(hù)作用。用R 不 P C R方法，以 初次感染互I e ， J e l a 飽子化卵囊( 約5 t 0 xl 。 ” 個(gè) / 雞) 的雞脾臟淋巴細(xì) 胞( s P )總R N A為模板， 成功 擴(kuò)增出 預(yù)計(jì)大 小的雞T G F 一 旦 ; c D N A基因、 并克隆入p M D l s 一 T 載 體， 澳 I J 序 結(jié) 果 顯示 其閱 讀

4、 框( o R F) 為3 4 5 b p ， 與G e n B a n k 上雞丁 G F -口 ; 基因 已 知 序列 ( M 3 ll 6 0 ) B L A s T的 結(jié)果 表明 : 核芬 酸和 氛基 酸的同 源 性分 別為9 9 . 7 % 和1 0 0 % . 將c h T G F 一 日 ; 基因 克隆 入p E T - 2 8 a 質(zhì) 粒， 構(gòu) 建了p E T Z s a 一 c h T G r 一 口 ;原核表達(dá)載體，

5、 I P T G誘導(dǎo)后表達(dá)出的融合 蛋白大小為1 7 k D。利用 D N A 重組技術(shù)，分別構(gòu)建了 D N A 疫苗 p c DN A 4乃 小 憶一 T G F一 p ; 和p V 人 叉 1 . 0 一 T G F 一 p ; 。 酶 切鑒 定 正 確 后， 分 別 用重 組 質(zhì) 粒 免及1 4 日 齡雞 ，1 周 后 取注 射部位、 非注射部位 肌肉 組織， 用R l 二 p C R和w e s t e r n 一 b l o

6、ti n g檢測(cè)保護(hù)性抗原的表達(dá)情況 。 結(jié)果 表明 該M Z S 一 7 基 因 和T G F 一 p ; 基因 均能 在 注 射部 位 肌肉 里 成功 表達(dá) 。設(shè) 立T G F一 p 4 重 組 蛋白 、 重 組 質(zhì) 粒p 、 I A x l . 。 T G F一 p ; 、 P c D N A 4 。 M z 一 T G F 一 p ; 三 個(gè)免疫組進(jìn)行免疫 保護(hù)試驗(yàn)，經(jīng) 胸部肌肉 分別于 1 4、 2 1 日 齡兩 次免授雛雞，

7、并設(shè)立感染非免疫和非感染非免疚對(duì)照及空質(zhì)粒組 2 8 日 齡經(jīng)口 接種新鮮的 云t e ， I ej l a 袍子化卵囊， 一周后宰殺 全部實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物， 進(jìn) 行盲腸病變計(jì)分、 克糞便卵囊數(shù)、 增重和綜合杭球蟲(chóng) 指數(shù)四 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)， 檢測(cè)其保護(hù)力 的大 小 結(jié)果 表明， 三個(gè)免疫組對(duì)感染球蟲(chóng) 雞 的 保 護(hù)效 果 一 般， 但都 可 以 顯 著 減 輕 球蟲(chóng) 感 染 后 的 盲 腸 病變 、 這 可 能 與 T G F 一 p 4英

8、文 摘 要THES TUDYON I M M UNE一 REGULA TI NG DN A 、 / ACCI NEP c D N A 4 . 0 一 MZ 一 T G F 一 p ; A G A I N S TE I ME R I AT E N E L L AABS TRACTT h e c o c c o c i d i o s i s o f c h i c k e n i s a c y to P l a s t i c e n

9、t o z o i c P a r a s i t e d i s e a s e a n d m 即c a u s es e v e r e e c o n o m i c l o s s t o t h e i n d u s t r yo f P o u l t r y C u r r e n t m e t h o d s f o r c o c c i d i o s 1 s c o n t r o I i nt h eP o

10、 u l t r yi n d u s t r yr e v e r s i o n t o v i 陽(yáng) l e n C eh a vem a n yd r a wb a c k s ， s u c ha s d r u g 一 r e s i s t a n c ea n dt h ep o t e n t i a lT h e r e f o r e ， D N Av a c c i n e sc o n t a i n i n g

11、i m P o r t a n t p a r a s i t i ch a v eb e e ns u g g e s t e da sa na l t e r n a t i v et ot h ev i r ul e n t o ra t t e n u a te dv a c c i n e sa n t l g e n sCh i c k e nT G F 一 p ;i sa nd a m n i f i c a t i o

12、ni m P o r t a n t c y to k i n ew h i c hh a s f un c t i o no nr e n o v a t i o na n dP r o m o t i o na f t e rT h e 入 1 2 5 一 7 i so n e o ft h em e r o z o i t e s ， a ndh a sb e e ns h o w nt oe l i c i ta n t i g

13、 e n s o f E in 護(hù) e r l at e n e l a s e c o n dg e n e r a t i o nP a r t i a l P r o t e c t i o ni nc h i c k e na g a i n s t a no r a lc h a l l e n g e w i t h 尤l e n e l a. I n t h i s r e p o r t ， w e c o n s t

14、r u c t e d i I n l n u n e r e g u l a t i v e D N Av a c c i n e b yt h ec o mb i n a t i o no f C h i c k e nT G F 一 p ; g e n e w i t h入 1 2 5 一 7 g e n eo f 云l e l ， e l a a n dt e s t e dt h e i rP r o t e c t i v

15、e e f ec t s o n t h e c h i c k e n a g a i n s t t h e c h a l l e n g e o f 人 t e ， ， e l aU s i n gt h es p l e e nl y m P h o c y t e s ( S p ) t o t a 1 R N Ao f c h i c k e n s i n f e c t e df i r s t l y w i t h

16、 Et e n e l l a s p o r u l a t e d o o c y s t s( 北 o u t s x l o 4 p e rc h i c k e n ) a s t h e t e m p l a t e ， t h e g e n e o f c h i c k e nt r a n s f o r m i n g f a c t o r - p w a s a m p l i f i e d a n d c

17、 l o n e d t h r o u g h t h e R T - p C RT h e p C Rp r o d u c t sw e r e t h e n c l o n e d i n t o p M D 1 8 一 T v e c t o r f o r s e q u e n c i n gT h e g e n e o R F w a s 3 4 5 b p ， a n d i tm a t c h e dw i t

18、 h t h eP r e d i c t e ds i z e . C o m P a r e dw i t ht h e P u b l i s h e ds e q u e n c ei nG e n B a n k( M3 1 1 6 O ) ， t h eh o m o l o g yo fn uc l e i ca c i d sa n da m i n oa c i d sw e r e9 9 . 7 % a n d 1

19、0 o %r e s P e c t i v e l yT h e g e n e w a s l a t e r s u b 一 c l o n e d i n t o a P r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r ， d e s i g n e da s P E T 2 8 a 一 T G F一 p 4 一A f t e r i n d u c t i o n b y

20、 I P T G， t h e C h T G F 一 p 4 g e n e w a s e x P r e s s e d a n d t h ef u s e d P r o t e i n w a s l 7 k DB yt h em e a n so fD N A r e c o m b i n a t i o nt e c h n i q u e ，p c D N A 4 o 一 M z 一 T G F 一 日 ;a n d