2014-2016年華東地區(qū)新城疫病毒的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)強(qiáng)毒株引起的一種急性烈性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。自1926年以來ND在世界上已引發(fā)了四次大的流行，每次大的流行都由新的基因型毒株所引起，NDV一直處于不斷的進(jìn)化之中，目前NDV已出現(xiàn)了多個(gè)不同的基因型。NDV自1946年在我國(guó)首次分離至今已70多年，其在我國(guó)長(zhǎng)期存在和流行，使養(yǎng)禽業(yè)發(fā)生NDV感染的風(fēng)險(xiǎn)一

2、直存在;此外我國(guó)新城疫病毒基因型的多樣性以及病毒的抗原變異，也給我國(guó)ND的防控帶來了挑戰(zhàn)。為了掌握NDV在不同禽群中的攜帶與感染情況，進(jìn)而為臨床上ND的防控提供重要依據(jù)，我們對(duì)2014-2016年華東地區(qū)不同禽群中的ND流行情況進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，利用建立的NDV新型RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)分離毒株進(jìn)行了基因型鑒定，并在此基礎(chǔ)上對(duì)病毒的遺傳進(jìn)化進(jìn)行了分析。
　　1.檢測(cè)所有NDV的一步法RT-PCR方法的建立
　　NDV分為class

3、Ⅰ和classⅡ兩大類，這兩類病毒之間的遺傳距離遠(yuǎn)，目前對(duì)NDV分離毒株進(jìn)行PCR鑒定時(shí)，往往需要分別設(shè)計(jì)針對(duì)classⅠ和classⅡ病毒基因組的特異引物。為了給臨床上提供一種能夠快速檢測(cè)所有NDV的RT-PCR方法，我們參考了兩類病毒多種基因型的F基因序列，設(shè)計(jì)出了廣譜性的通用引物，在此基礎(chǔ)上建立了可檢測(cè)包括classⅠ和classⅡ在內(nèi)所有毒株的一步RT-PCR方法。通過對(duì)退火溫度、模板濃度、循環(huán)次數(shù)、反轉(zhuǎn)錄時(shí)間四個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化后

4、，獲得了RT-PCR反應(yīng)的最佳條件。不同基因型毒株的擴(kuò)增結(jié)果表明該方法能成功擴(kuò)增出所有受試classⅠ和classⅡ毒株的目的片段。此外新型一步RT-PCR方法擴(kuò)增的片段還可以用于基因分型與毒力分析，因此該方法的建立為臨床上NDV的快速鑒定提供了更為便捷的方法。
　　2.2014-2016年華東地區(qū)活禽市場(chǎng)NDV的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析
　　本文于2014-2016年在華東地區(qū)活禽市場(chǎng)中采集不同禽群泄殖腔棉拭樣品2101份，

5、從中分離到56份NDV陽性樣品，樣品的分離率為2.67％。鑒定結(jié)果顯示classⅠ樣品為42份，分離率為2％，classⅡ陽性樣品14份，其中基因Ⅰ型NDV4株，基因Ⅱ型病毒8株，基因Ⅶ型病毒2株。遺傳進(jìn)化分析表明，基因Ⅰ型和Ⅱ型毒株分別與疫苗株Ⅴ4和LaSota具有很高的同源性，推測(cè)其可能來源于我國(guó)廣泛使用的疫苗株;基因Ⅶ型毒株為當(dāng)前流行的Ⅶd2亞型。在42株classⅠ類NDV中，31株為雞源，11株為水禽源，表明其在雞群中分離率已

6、明顯高于水禽。遺傳進(jìn)化分析顯示42株NDV全部屬于3c亞型，該亞型已成為華東地區(qū)活禽市場(chǎng)中classⅠ毒株的優(yōu)勢(shì)基因型。
　　3.2014-2016年臨床樣品中NDV的分離鑒定及遺傳進(jìn)化分析
　　2014-2016年在我國(guó)江蘇、山東等地收集并處理疑似病料185份，分離NDV47株，全為classⅡ類病毒，其中基因Ⅰ型6株、Ⅱ型29株、Ⅶ型12株，基因Ⅰ和Ⅱ型分別與疫苗株Ⅴ4和LaSota具有很高的同源性?；颌餍头蛛x毒株的遺

7、傳進(jìn)化分析顯示，基因Ⅶ型分離毒株均屬于基因Ⅶd2亞型，說明基因Ⅶd2亞型仍然為華東地區(qū)NDV優(yōu)勢(shì)流行株。Ⅶ型分離株F基因核苷酸和氨基酸之間的同源性分別為96-100％和97.5-100％; HN基因核苷酸和氨基酸之間的同源性分別為96.6-99.9％和97.6-100％。HN蛋白線性表位氨基酸位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，10/14毒株發(fā)生E347K變異，血清交叉中和試驗(yàn)顯示HN蛋白E347K變異可對(duì)病毒的抗原性產(chǎn)生明顯影響。
　　此外，本文選取