一株ClassⅠ新城疫病毒的分離鑒定及生物學(xué)特性初步研究.pdf

1、新城疫病毒是世界公認(rèn)的重要的禽類傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須通報(bào)的疫病。近年來(lái)，不斷有報(bào)道在北美、歐洲及香港等地的水禽與活禽市場(chǎng)中分離到多株不同基因型的Class I新城疫病毒，該病毒與目前流行的Class II新城疫病毒在遺傳特性和抗原性上差異明顯，分子流行病學(xué)分析顯示其屬于兩個(gè)不同的進(jìn)化分枝，對(duì)于這種Class I新城疫病毒的起源以及在家禽新城疫發(fā)生和流行過(guò)程中的作用日益得到關(guān)注。 本研究對(duì)從國(guó)內(nèi)健康鴨中分

2、離到的一株Class I新城疫病毒株的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，通過(guò)對(duì)其全基因組的序列測(cè)定，對(duì)其遺傳學(xué)特性進(jìn)行了研究，通過(guò)交叉血凝抑制試驗(yàn)(Cross-HI)對(duì)其和經(jīng)典新城疫病毒在抗原性上的差異進(jìn)行了研究。結(jié)果表明Class I與Class II新城疫病毒在抗原性上存在較大差異，這是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道該類型新城疫病毒的存在。本課題分為以下3個(gè)部分。 1.新城疫病毒ND08-004株的分離鑒定及部分生物學(xué)特性研究 從健康鴨中，采

3、用常規(guī)的病毒分離培養(yǎng)、血凝試驗(yàn)(HA)、血凝抑制試驗(yàn)(HI)以及提取RNA進(jìn)行F蛋白基因的RT-PCR反應(yīng)，成功分離并鑒定出一株新城疫病毒，命名為ND08-004。通過(guò)蝕斑純化，對(duì)其致病指數(shù)(MDT和ICPI)進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，該毒株不能致死雞胚，ICPI為0.29，分離株F蛋白裂解位點(diǎn)的組成為112E-Q-Q-E-R-L117，具有典型新城疫弱毒株的分子特征。通過(guò)NDV分子流行病學(xué)分析顯示該分離株在分類地位上屬于Class I，與

4、近年來(lái)香港活禽市場(chǎng)分離株較為類似，同屬于基因3型。 2.新城疫病毒株ND08-004全基因組序列測(cè)定 依據(jù)GenBank公布的新城疫病毒的基因組序列，自行設(shè)計(jì)8對(duì)特異性引物，運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)獲取了覆蓋ND08-004株全基因組的8個(gè)重疊片段。病毒RNA的5’及3’端的序列通過(guò)cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)獲取。通過(guò)對(duì)全基因組的拼接和分析顯示該分離株基因組長(zhǎng)度為15198個(gè)核苷酸，基因組長(zhǎng)度符

5、合“六堿基法則”，與GenBank中發(fā)表的Class II新城疫病毒相比，該毒株在ND08-004株的P基因495nt～496nt位多出12個(gè)核苷酸，ZJ1、SR203、SF02等毒株(15192bp)在NP基因非編碼區(qū)，全基因組1647～1648nt比ND08-004株多6個(gè)核苷酸。 ND08-004與7株Class II NDV毒株V4、B1、LaSota、Mukteswa、Herts/33、ZJ-1、SF02在0～55n

6、t位的Leader序列的同源性在85.5％～89.1％之間，與DE-R49/99株在該段基因序列的同源性為94.5％，7株Class II NDV毒株的該片段基因序列的同源性在85.5％～98.2％之間。ND08-004與V4、B1、LaSota、Mukteswa、Herts/33在15073～15186nt位的Trailer序列的同源性在57.9％～58.8％之間，與ZJ-1、SF02在15079～15192nt位的Trailer序列

7、的同源性均為24.6％，與DE-R49/99在該段基因序列的同源性為88.6％。 3.ND08-004株和經(jīng)典新城疫毒株抗原性的比較 分別以弱毒疫苗Lasota株、基因VII型代表株寧夏分離株、ND08-004株和F48E8株為滅活疫苗制備相應(yīng)的抗血清。將四株病毒分別與相應(yīng)的抗血清做交叉血凝抑制試驗(yàn)(Cross-HI)，以次來(lái)比較不同來(lái)源病毒間的抗原同源性關(guān)系。在交叉HI中，ND08-004株與LaSota株的抗原性的同