多功能天然高分子納米藥物輸送體系的構建及抗腫瘤研究.pdf

1、近年來，隨著材料科學和納米技術的發(fā)展，納米藥物輸送體系的研究不斷深入，目前已成為腫瘤治療的研究熱點。與傳統(tǒng)小分子化療藥物相比，納米藥物載體能顯著提高負載藥物的腫瘤傳輸效率并降低藥物的副作用。納米藥物載體之所以能夠向腫瘤和正常組織差異性的輸送治療藥物，是基于其對腫瘤組織的高滲透性和滯留效應(EPR effect)。由于腫瘤周圍血管異常和淋巴回流缺失，納米藥物載體可穿透腫瘤組織并在特定部位釋放藥物，從而減少對正常組織的損傷，減少副作用。然而

2、，納米藥物載體在腫瘤中的傳輸過程主要包括血管傳輸，跨血管傳輸和腫瘤間質傳輸三個主要步驟，而由于腫瘤生理的異常，如致密的細胞外基質(ECM)、淋巴系統(tǒng)的缺失引起升高的間隙壓力等，每一個傳輸過程都是納米藥物載體向腫瘤實質滲透時需要克服的屏障。通過EPR效應被動富集在腫瘤的納米載體，雖然可以從血管中滲出，但不能有效的穿過ECM，只能在血管周圍不均勻堆積，無法有效的被癌細胞攝取，大大降低了抗腫瘤效果。另外由于EPR效應受腫瘤位置，巨噬細胞浸潤量

3、，孔徑大小等因素的影響，被動靶向僅限于某些類型的腫瘤，而且EPR效應僅限于一些直徑大于約4.6mm的實體瘤。為了克服這些缺點，本論文通過在納米載體表面共價修飾腫瘤靶向配體（苯硼酸、乳糖酸）及可以降解ECM的蛋白酶（菠蘿蛋白酶），構成多功能納米載體，有望克服單功能納米藥物載體在腫瘤中的滲透障礙，增強藥物的腫瘤富集、滲透和細胞攝取，從而提高抗腫瘤效果。此外，由于天然高分子材料不僅來源廣泛，價格便宜，易修飾，能夠大批量的分離和提純，以及良好的

4、生物相容性和生物可降解性，安全無毒等優(yōu)點。因此，本論文選擇以天然高分子為基材設計制備了一系列納米藥物傳遞系統(tǒng)?？傊菊撐脑O計的多功能納米粒子具有設計簡單、結構與功能精確可控以及生物可降解等優(yōu)點，對納米載體在抗腫瘤治療領域的應用和新型納米載藥體系的發(fā)展意義重大。研究內容主要分如下三個部分:
　　(1)以生物相容性良好的明膠(Type B)為起始材料，通過去溶劑法成功制備了明膠納米粒子(NPl)。將腫瘤靶向配體3-羧基苯硼酸(3-C

5、PBA)通過共價作用修飾在NP1表面構建了具有腫瘤靶向功能的納米粒子(NP2)。通過透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(SEM)和動態(tài)光散射(DLS)研究了NP1和NP2的形貌結構和穩(wěn)定性。結果表明，NP1和NP2均呈球形結構，并在各種條件下具有較好的動力學穩(wěn)定性。選擇阿霉素(DOX)作為抗腫瘤藥物模型并將其負載到NP1和NP2分別得到載藥納米粒子NPl-DOX和NP2-DOX，在不同pH值下考察了載藥納米粒子的藥物釋放行為，發(fā)現(xiàn)隨著pH從7

6、.4下降到5.0，納米粒子的阿霉素釋放速率顯著增加。分別利用平面細胞模型（SH-SY5Y細胞、H22細胞和HepG2細胞）和三維(3D)培養(yǎng)的多細胞球體(SH-SY5YMCS)通過激光共聚焦顯微鏡(CLSM)、流式細胞儀(FCM)和MTT法等系統(tǒng)研究了NPl-DOX和NP2-DOX的體外細胞攝取及細胞毒性。最后，通過H22荷瘤小鼠模型利用近紅外活體成像儀、腫瘤組織病理學分析、抗腫瘤實驗等方法研究了兩種載藥納米粒子的腫瘤富集、滲透及抑制能

7、力。所有結果表明，通過3-CPBA的修飾，可以顯著提高納米粒子的腫瘤識別能力，從而提高其在腫瘤部位的富集和抗腫瘤效果。
　　(2)以水溶性和生物相容性優(yōu)良的羧甲基殼聚糖(CMCS)為起始材料，通過去溶劑法制備了羧甲基殼聚糖納米粒子(CM NPs)。選擇3-羧基苯硼酸（3-CPBA）作為腫瘤靶向配體，將其修飾到CM NPs表面得到具有腫瘤靶向功能的納米粒子(CB NPs)。利用動態(tài)光散射(DLS)、透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SE

8、M)對兩種納米粒子的粒徑大小、形貌結構和穩(wěn)定性進行表征。結果表明，CM NPs和CB NPs均顯示接近球形結構，大小均一，且在各種條件下具有較好的動力學穩(wěn)定性。阿霉素(DOX)作為模型藥物成功包載于納米粒子得到載藥納米粒子CM-DOX和CB-DOX NPs。通過單層細胞模型和三維多細胞球體(MCS)研究了這些載藥納米粒子的生物學效應。結果表明3-CPBA的修飾可以提高納米粒子的腫瘤富集和滲透能力。利用H22腫瘤肺轉移小鼠模型評價了這些載

9、藥納米粒子的體內抗腫瘤效果。結果表明，與CM-DOX NPs相比，CB-DOXNPs具有較好的腫瘤富集和滯留能力，從而顯著減小了H22腫瘤肺轉移小鼠的腫瘤大小。所有結果證明，CB NPs作為一種新型納米藥物載體，在腫瘤靶向給藥方面具有很大的潛力。
　　(3)腫瘤細胞外基質(ECM)是阻礙藥物在腫瘤組織中擴散的主要障礙。針對此問題，選擇良好生物相容性的殼聚糖作為起始材料，首先利用乳糖酸與腫瘤細胞表面過表達受體（脫唾液酸糖蛋白）的特異

10、性識別作用，將腫瘤靶向配體乳糖酸修飾到殼聚糖表面得到腫瘤靶向的聚合物(CLA)，通過去溶劑法成功制備了CLANPs。隨后通過共價作用將菠蘿蛋白酶修飾在CLA NPs表面得到CLABNPs，提高其穿透ECM到達腫瘤細胞的能力。利用動態(tài)光散射(DLS)、透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)測定和觀察了這些納米粒子的粒徑大小、形貌結構以及在不同條件下的穩(wěn)定性。將阿霉素(DOX)作為模型藥物成功包載于CLA和CLAB NPs，并在

11、三種不同pH（7.4，6.5和5.5）下考察了其藥物釋放曲線。酶活性實驗證明，修飾到納米粒子表面的菠蘿蛋白酶仍保持其酶活性。利用HepG2和SH-SY5Y細胞進行了細胞攝取和細胞毒性實驗，結果表明，與游離DOX相比，乳糖酸修飾的腫瘤靶向納米粒子顯示出對肝癌細胞的高選擇性以誘導有效的細胞毒性作用。體外三維(3-D)培養(yǎng)的多細胞球體（SH-SY5Y和HepG2MCS）實驗表明CLAB-DOX NPs顯著提高了DOX在MCS中的滲透。體內藥物