Ghrelin通過MAPK-ERK信號通路抑制血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分Ghrelin抑制血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的分化
　　目的:確定Ghrelin對血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的影響
　　方法:分離、培養(yǎng)和鑒定小鼠血管平滑肌細(xì)胞，用10-6 mol/LGhrelin干預(yù)，0、24、48、72小時后，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清。以ALP檢測試劑盒檢測不同時間點(diǎn)細(xì)胞ALP的表達(dá)差異;觀察礦化結(jié)節(jié)形成，并測定礦化結(jié)節(jié)的鈣含量;以蛋白免疫印跡檢測Runx2蛋白表達(dá)的差異。
　　結(jié)果:Ghr

2、elin干預(yù)血管平滑肌細(xì)胞后，與對照組相比，Ghrelin干預(yù)組中ALP的活性明顯受到抑制，而且為時間依賴性，具體表現(xiàn)為24小時出現(xiàn)受抑制，48小時達(dá)到高峰。培養(yǎng)12天以后，Ghrelin抑制血管平滑肌細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成，對照組的鈣含量顯著高于Ghrelin干預(yù)組。兩組的Runx2表達(dá)與ALP活性變化相似，在與Ghrelin共同培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞中，Runx2的表達(dá)顯著低于對照組。
　　結(jié)論:Ghrelin呈時間依賴性抑制ALP

3、活性和Runx2表達(dá)，減少礦化結(jié)節(jié)的形成，提示Ghrelin抑制血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化。
　　第二部分Ghrelin調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化過程中的MAPK信號分子變化
　　目的:探討Ghrelin是否影響血管平滑肌細(xì)胞中的MAPK信號通路活性。
　　方法:Ghrelin干預(yù)小鼠血管平滑肌細(xì)胞0、5、10、15、30和60分鐘。分別提取細(xì)胞總蛋白，蛋白免疫印跡檢測p-ERK、總ERK、p-p38、總p

4、38、p-JNK和總JNK的表達(dá)量。
　　結(jié)果:Ghrelin干預(yù)5分鐘時，可檢測出微弱磷酸化ERK信號，隨干預(yù)時間延長至10分鐘、15分鐘和30分鐘，磷酸化ERK蛋白表達(dá)漸次增強(qiáng)，30分鐘達(dá)到表達(dá)高峰，但一直無法檢測到JNK和p38磷酸化信號。
　　結(jié)論:Ghrelin激活血管平滑肌細(xì)胞MAPK-ERK信號通路活性。
　　第三部分Ghrelin調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的細(xì)胞信號機(jī)制研究
　　目的:探討

5、Ghrelin調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化的信號傳導(dǎo)途徑與作用模式。
　　方法:用RNA干擾(siRNA)技術(shù)阻斷血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)生長激素促分泌素受體(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)，用ERK信號通路阻斷劑PD98059阻斷ERK磷酸化，然后以10-6 MGhrelin干預(yù)GHSR-siRNA組、陰性對照組、空白對照組及PD98059組的血管平滑肌細(xì)胞，同時以未用Ghr

6、elin干預(yù)的陰性對照組、PD98059組、空白組做為對照，培養(yǎng)72小時后，應(yīng)用蛋白免疫印跡檢測p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)以及測定各組ALP活性。
　　結(jié)果:RNA干擾(siRNA)能成功沉默GHSR，在Ghrelin干預(yù)情況下，GHSR-siRNA組血管平滑肌細(xì)胞ERK磷酸化被顯著抑制，而陰性對照組和空白對照組的血管平滑肌細(xì)胞ERK信號途徑依然被激活。ERK信號通路阻斷劑PD98059可以有效阻斷Ghrelin干預(yù)后的ERK磷

7、酸化。在Ghrelin干預(yù)情況下，陰性對照組和GHSR-siRNA組的ALP活性有統(tǒng)計學(xué)差異，陰性對照組明顯低于GHSR-siRNA組(P＜0.01)，同時PD98059組及空白組的ALP活性有統(tǒng)計學(xué)差異，PD98059組顯著高于空白組(P＜0.01)。
　　結(jié)論:Ghrelin通過激活ERK磷酸化抑制血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞的分化。
　　第四部分中層鈣化動脈中GHSR-Ia、Runx2和Ghrelin的表達(dá)水平及相互關(guān)系

8、
　　目的:檢測GHSR-Ia、Runx2和Ghrelin蛋白在中層鈣化動脈和正常動脈中的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討Ghrelin在調(diào)控動脈中層鈣化中的病理機(jī)制。
　　方法:采用Van Kossa銀染色法證實(shí)動脈中層鈣化的發(fā)生，使用免疫組織化學(xué)方法檢測GHSR-Ia、Runx2和Ghrelin蛋白在鈣化動脈和正常動脈中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:在中層鈣化的動脈中，GHSR-Ia表達(dá)下調(diào)和Runx2高表達(dá)同時存在。鈣化動脈和正常

9、動脈中的GHSR-Ia陽性表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05)，鈣化動脈組明顯低于未鈣化組，Runx2陽性表達(dá)在兩組間差異也有顯著性(P＜0.05)，鈣化動脈組明顯高于于未鈣化組，且GHSR-Ia和Runx2的陽性表達(dá)率呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。而Ghrelin在鈣化動脈和未鈣化動脈中的陽性表達(dá)率無明顯差異(P＞0.05)，與GHSR-Ia、Runx2的表達(dá)無相關(guān)性(P＞0.01)。
　　結(jié)論:在中層鈣化的動脈中，GHSR-Ia表達(dá)下