丹參素在大鼠原代肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)運機(jī)制的研究.pdf

1、背景：
　　 丹參素(danshensu、Salvianic acid A)是從丹參中分離出的一種酚性芳香酸類化合物，是丹參水提取物中重要的有效活性成分之一，由于丹參素是一種游離酸，性質(zhì)不穩(wěn)定，故將其制成鈉鹽以提高穩(wěn)定性及純度。丹參素具有明顯的藥理活性，主要用于心血管系統(tǒng)疾病，丹參素在體內(nèi)可被快速吸收，但消除速率比較慢。利用Caco-2細(xì)胞單層模型證實丹參素可能由P-gp(P-糖蛋白)介導(dǎo)轉(zhuǎn)運，肝臟組織中卻同樣保持著較高的濃度，

2、探究丹參素在肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運機(jī)制。
　　 目的：
　　 本課題旨在利用大鼠原代肝細(xì)胞模型從細(xì)胞水平上研究丹參素在肝細(xì)胞中的攝取和轉(zhuǎn)運過程，并選取有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽1b2抑制劑為探針，探討丹參素在大鼠原代肝細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)運與有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽1b2的內(nèi)在聯(lián)系，以此闡明丹參素在肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1建立大鼠原代肝細(xì)胞的分離方法以及大鼠肝細(xì)胞體外溫孵體系的條件，全面評價大鼠原代肝細(xì)胞模型的特性

3、，采用該細(xì)胞模型試驗觀察丹參素攝取和轉(zhuǎn)運過程。
　　 2摸索和建立LC-MS檢測丹參素肝細(xì)胞樣本的方法。
　　 3考察溫孵體系因素溫度、時間、濃度對丹參素肝細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)運的作用。
　　 4利福平對肝細(xì)胞中丹參素的作用。實驗分為12組，對照組丹參素(0.1mM、0.5mM、1.0mM)，利福平(0.5μM、1.0μM、2.0μM)+0.1mM丹參素組，利福平(0.5μM、1.0μM、2.0μM)+0.5mM丹參素組，

4、利福平(0.5μM、1.0μM、2.0μM)+1.0mM丹參素組，每組設(shè)置四個復(fù)孔。通過不同組肝細(xì)胞實驗，研究利福平對丹參素的肝臟攝取情況的影響，進(jìn)一步探討Oatp1b2與丹參素肝臟攝取轉(zhuǎn)運之間的密切關(guān)聯(lián)。
　　 5所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，統(tǒng)計分析采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間差異采用設(shè)計的t檢驗，統(tǒng)計結(jié)果以P<0.05為具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1建立的LC-M

5、S檢測方法完全能夠符合丹參素肝細(xì)胞樣本的分析測試的要求，具有較高的靈敏度和特異性。
　　 2成功地建立了大鼠原代肝細(xì)胞的分離方法，確定了大鼠原代肝細(xì)胞溫孵體系的適用條件，為本課題實施奠定了可靠的基礎(chǔ)。
　　 3考察體系溫度、時間和濃度對肝細(xì)胞中丹參素攝取轉(zhuǎn)運的影響結(jié)果：丹參素攝取進(jìn)入肝細(xì)胞在0-20min幾乎呈線性增加，20分鐘后上升平緩并逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)；丹參素在62.5-1000μM藥物濃度范圍內(nèi)時，其攝取轉(zhuǎn)運量隨著

6、藥物濃度的增加而增加，當(dāng)藥物濃度達(dá)到1000μM，攝取轉(zhuǎn)運量增長趨于平緩，高濃度丹參素攝取達(dá)到飽和；體系溫度為4℃、25℃、37℃時原代肝細(xì)胞對丹參素的攝取量分別為26.88±0.53，26.44±1.98，28.97±1.55 nmol·mg-1 protein，統(tǒng)計分析得出P>0.05，表明無顯著性差異，表明大鼠原代肝細(xì)胞對丹參素的攝取受溫度的影響不大。
　　 4 Oatp1b2的抑制劑對丹參素的作用結(jié)果顯示：濃度為0.5μ

7、M的利福平對三種濃度的丹參素(0.1mM、0.5mM、1.0mM)抑制率為23.64％、16.61％、6.69％；濃度為1.0μM的利福平對三種濃度的丹參素(0.1mM、0.5mM、1.0mM)抑制率為31.62％、35.21％、7.12％；濃度為2.0μM的利福平對三種濃度的丹參素(0.1mM、0.5mM、1.0mM)抑制率為52.09％、46.45％、14.48％；隨著利福平濃度的不斷增加，對丹參素的抑制作用就越明顯，不同濃度利福平

8、加入后與對照組比較，方差分析和t檢驗結(jié)果呈現(xiàn)顯著性差異，該差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 本課題首次系統(tǒng)全面地研究丹參素進(jìn)入肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運過程，成為了本文的創(chuàng)新之處。目前的研究結(jié)果認(rèn)為丹參素通過有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽以主動轉(zhuǎn)運方式進(jìn)入肝臟發(fā)揮作用；利福平能夠競爭性抑制丹參素進(jìn)入肝細(xì)胞發(fā)揮作用，丹參素對肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用；以抑制劑為探針，能夠確定有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽的位點為Oatp1b2。初步得到丹參素在大鼠原代肝細(xì)