2014年深圳市1型登革病毒流行株的分子溯源及全基因組序列分析.pdf

1、目的：研究對(duì)象為深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院2014年9～12月期間收治的登革熱病例。對(duì)2014年9～12月深圳市登革熱流行病毒株進(jìn)行血清型別鑒定，了解此次登革熱病原學(xué)的血清型情況;對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)分離獲得的登革病毒株E基因及全基因組序列，進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹(shù)分析，從分子水平上探討2014年深圳登革病毒流行株的生物學(xué)特征，探討其可能的來(lái)源。
　　方法：1.收集確診登革熱患者的病例資料，包括流行病學(xué)資料、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查，其中登革熱病毒的血

2、清學(xué)和核酸檢測(cè)由深圳市疾控中心(CDC)完成。
　　2.提取患者急性期血清標(biāo)本中登革病毒RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)通用引物及型特異性引物二輪PCR擴(kuò)增后，根據(jù)產(chǎn)物分子量大小確定登革病毒血清型。
　　3.用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)分離6例1型登革病毒感染患者的急性期血清中的登革病毒。
　　4.用Primer3.0及DNAMAN軟件設(shè)計(jì)2對(duì)1型登革病毒的E基因擴(kuò)增測(cè)序引物，RT-PCR擴(kuò)增6株深圳1型登革病毒全長(zhǎng)E基因，產(chǎn)物

3、經(jīng)測(cè)序、拼接后，進(jìn)行同源性與進(jìn)化樹(shù)分析。
　　5.使用PCR DESIGN及DNAMAN軟件，設(shè)計(jì)11對(duì)PCR引物，RT-PCR擴(kuò)增2株1型登革病毒株全基因組序列，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行信息學(xué)分析。
　　結(jié)果：1.共35例患者確診為登革熱病例，本地流行病例占80.0％，而輸入性病例僅占20.0％。
　　2.21例患者經(jīng)RT-nPCR檢測(cè)陽(yáng)性，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后，20例出現(xiàn)大小為482bp的登革病毒型特異性片段，判定系

4、登革1型病毒感染者，僅1例出現(xiàn)大小為119bp的登革2型病毒型特異性片段。前者本地感染及輸入性感染病例數(shù)分別為16例(80.0％)和4(20.0％)，后者為輸入性病例。
　　3.用BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)分離PCR陽(yáng)性的6名登革1型病毒患者急性期血清標(biāo)本中的登革病毒株，6份標(biāo)本均出現(xiàn)細(xì)胞腫脹變圓、空泡結(jié)構(gòu)等細(xì)胞病變效應(yīng)。
　　4.6株深圳1型登革病毒株感染患者經(jīng)E基因擴(kuò)增、測(cè)序，全長(zhǎng)均為1485bp，編碼495個(gè)氨基酸。6株深圳

5、登革1型病毒分離株同源性為100.0％，其同源性與深圳2010流行株接近，核苷酸和氨基酸同源性分別為99.5％、99.8％，與新加坡2009和日本2004流行株的核苷酸和氨基酸同源性最高達(dá)99.7％、100.0％。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，深圳6株登革1型病毒均屬于基因型Ⅰ型，與Shenzhen2010、Singpore2009、Japan2004的親緣關(guān)系較近，均在同一進(jìn)化支上。
　　5.對(duì)從2例患者分離的DENV-1株進(jìn)行全基因組測(cè)序，結(jié)

6、果顯示2株深圳DENV-1同源性為100.0％。深圳登革1型病毒株全長(zhǎng)均為10735bp，編碼3329個(gè)氨基酸;全基因組序列進(jìn)化分析表明此病毒株為基因亞型Ⅰ毒株，與東南亞的病毒株同源性最高。與我國(guó)登革1型病毒基因亞型Ⅰ毒株GZ/80相比，深圳2014年登革1型病毒株發(fā)生了堿基變異430個(gè)，氨基酸變異42個(gè)，5'非編碼區(qū)(UTR)存在1處堿基差異，形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)相同，均形成7個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，3'UTR序列共有8處位點(diǎn)發(fā)生變異，前者形成了21

7、個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，而后者形成了24個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：1.2014年深圳以登革1型病毒流行為主，基因亞型屬Ⅰ型，且主要是本地流行;
　　2.2014年流行于深圳市的登革1型病毒分離株，無(wú)論從E基因進(jìn)化樹(shù)還是全基因組序列進(jìn)化樹(shù)分析，均與新加坡、馬來(lái)西亞等東南亞分離株同源度最高，提示此次深圳流行的登革1型病毒可能來(lái)源于東南亞一帶;
　　3.2014年6株深圳登革1型病毒分離株與2010年深圳登革1型病毒本地分離株比較發(fā)現(xiàn)