HCV1b型全基因組擴(kuò)增及序列分析.pdf

1、目的：
　　丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是全球性公共衛(wèi)生問題，目前全世界感染人數(shù)約1.7億，其中85％將發(fā)展成為慢性丙型肝炎?，F(xiàn)有的抗HCV唯一標(biāo)準(zhǔn)治療方案是聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林，但該療法對病毒基因型有很強(qiáng)的依賴性，2、3型感染者獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR)率為70％～90％，而1、4型感染者僅為40％～60％。缺乏高效的體外細(xì)胞

2、復(fù)制體系和小動物模型是阻礙HCV致病機(jī)制研究及抗病毒藥物研發(fā)的主要原因。1999年Lohmann等建立的選擇性雙順反子亞基因組HCV RNA復(fù)制子系統(tǒng)標(biāo)志著HCV體外培養(yǎng)技術(shù)的一大進(jìn)步，為HCV的基礎(chǔ)研究和藥物篩選提供了一個新的平臺。該亞基因組復(fù)制子將編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因刪除，用2個異源性成分取而代之，其一為選擇性標(biāo)志物新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因，其二為腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus，EMCV)的內(nèi)

3、部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site IRES)。上游順反子在HCV IRES作用下啟動新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)，下游順反子在EMCV IRES作用下啟動HCV NS3～5B蛋白質(zhì)的翻譯。通過轉(zhuǎn)染Huh-7細(xì)胞和G418篩選，獲得的選擇性HCV RNA復(fù)制子雖能在Huh-7細(xì)胞中穩(wěn)定高效地自主復(fù)制，但需細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性突變，且轉(zhuǎn)染效率極低。由于結(jié)構(gòu)基因的刪除，HCV亞基因組復(fù)制子不能產(chǎn)生完整的病毒顆粒

4、，無法用于HCV生活周期、病毒組裝釋放及HCV結(jié)構(gòu)蛋白的研究。之后研究者用HCV全長基因組替換亞基因組復(fù)制子的NS3～5B，構(gòu)建了HCV全基因組復(fù)制子。同亞基因組復(fù)制子一樣，全基因組復(fù)制子也需進(jìn)行體外適應(yīng)性突變后才能獲得高效的復(fù)制能力，且同樣無法產(chǎn)生感染性病毒顆粒，不能完全代表HCV在體內(nèi)的復(fù)制過程。2005年JFH-1體外細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立成為HCV發(fā)展史上的里程碑。JFH-1系從日本1例暴發(fā)性丙型肝炎患者體內(nèi)分離獲得，其基因型為HC

5、V2a型，是迄今唯一無需適應(yīng)性突變即能在體外高效復(fù)制并產(chǎn)生感染性病毒顆粒的毒株。然而，HCV是一具有高度異質(zhì)性的病毒，JFH-1與其他基因型病毒株在生物學(xué)性狀、臨床特征及治療效果等方面均有很大差異，無法代表所有HCV的特性。因此，建立能產(chǎn)生完整病毒顆粒的HCV各基因型細(xì)胞培養(yǎng)模型是當(dāng)前HCV研究的重要任務(wù)。
　　獲取HCV全長基因組序列是構(gòu)建HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外雖已構(gòu)建了大量的HCV全基因組克隆，但均是通過短片

6、段擴(kuò)增、拼接而成。由于HCV存在極其復(fù)雜的準(zhǔn)種特性，這種多片段拼接易造成不同變異株間的錯誤連接，得到的只是人工重組體，而不是患者體內(nèi)真實(shí)存在的病毒基因組。采用長鏈RT-nested-PCR方法一次性擴(kuò)增出HCV基因組全長片段可以完全避免上述問題，但難度很大，國內(nèi)外均未獲成功。HCV基因組具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)、鳥嘌呤和胞嘧啶(guanine and cytosine，GC)含量高、血清HCV RNA濃度低、難以通過逆轉(zhuǎn)錄獲得長9.6kb的完

7、整cDNA模板等都是導(dǎo)致HCV全基因組擴(kuò)增失敗的原因。目前報道的從患者血清一次性擴(kuò)增出的HCV基因組最長片段為9.1kb，其擴(kuò)增片段未包含病毒基因組包裝和復(fù)制所必須的結(jié)構(gòu)3’UTR，無法用于體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立。
　　針對上述問題，本課題通過對HCV全基因組長鏈RT-nested-PCR擴(kuò)增方案的不斷摸索、優(yōu)化，旨在一次性擴(kuò)增出包括5’、3’UTR在內(nèi)的HCV基因組全長，構(gòu)建真實(shí)可靠的HCV全基因組克隆，為進(jìn)一步構(gòu)建HCV體外細(xì)

8、胞培養(yǎng)模型奠定基礎(chǔ)。
　　本研究分為三個部分：第一部分以pJFH-1質(zhì)粒為模板，通過優(yōu)化長鏈PCR反應(yīng)體系及條件，建立適用于HCV全基因組擴(kuò)增的長鏈PCR方案；第二部分在第一部分的基礎(chǔ)上，改進(jìn)HCV長鏈RT及nested-PCR方案，建立從血清一次性擴(kuò)增HCV基因組全長的長鏈RT-nested-PCR方法，并構(gòu)建HCV全長基因組克隆，為建立中國人HCV體外復(fù)制子模型奠定基礎(chǔ)；第三部分對所克隆HCV全基因組序列進(jìn)行基因分型、進(jìn)化分析

9、，并對其復(fù)制能力進(jìn)行了初步預(yù)測，為下一步構(gòu)建HCV體外細(xì)胞復(fù)制模型提供理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1．HCV長鏈PCR方法的建立和優(yōu)化：以pJFH-1質(zhì)粒為測試模板，通過長鏈PCR引物的篩選、PCR DNA聚合酶的比較、甘油或/和DMSO最適濃度的篩選、循環(huán)條件的摸索等，建立能穩(wěn)定擴(kuò)增HCV全基因組的長鏈PCR方案。
　　2．HCV長鏈RT-nested-PCR方法的建立和優(yōu)化：以GenBank中所有HCV全長序

10、列為參考，在Poly(U/UC)區(qū)后選擇相對保守、GC含量適宜的區(qū)域進(jìn)行長鏈RT及nested-PCR引物的設(shè)計。由于HCV全長約9.6kb，獲得完整cDNA難度很大，因此在5’UTR和NS5B區(qū)各設(shè)計了一對PCR引物用于驗(yàn)證cDNA完整性。通過長鏈RT及nested-PCR引物的篩選、多種RNA提取方法的比較、RT反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化、長鏈nested-PCR方案的優(yōu)化，建立HCV全長RT-nested-PCR擴(kuò)增方案。
　　3

11、．HCV全基因組克隆的構(gòu)建：將獲得的HCV全基因組片段通過膠回收純化、TA克隆、轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞獲得HCV全長基因組克隆并驗(yàn)證。
　　4．HCV全長序列的分析：通過對測序結(jié)果處理、拼接獲得HCV全長序列。繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行同源性分析，并對其復(fù)制能力進(jìn)行初步預(yù)測，為下一步構(gòu)建HCV體外細(xì)胞復(fù)制模型提供理論依據(jù)。
　　結(jié)果：
　　1．建立了HCV全基因組長鏈RT-nested-PCR擴(kuò)增方案：設(shè)計的長鏈RT引物(R

12、TP-1)及nested-PCR引物(外側(cè)引物對ESP-1、EAP-1；內(nèi)側(cè)引物對ISP-1、IAP-1)能穩(wěn)定擴(kuò)增出HCV基因組全長；采用Qiagen公司的QIAamp viral RNA mini kit提取可得到完整的RNA模板；RT反應(yīng)選用invitrogen公司的SuperScript III，用優(yōu)化的RT條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可獲得完整的cDNA。長鏈nested-PCR選用invitrogen公司的Platinum Taq D

13、NA Polymerase High Fidelity，反應(yīng)條件為94℃2min；94℃15sec、68℃9.5min，15個循環(huán)；94℃15sec、68℃9.5min+10sec/cycle，20個循環(huán)；然后68℃10min可成功實(shí)現(xiàn)HCV全長的擴(kuò)增。
　　2．構(gòu)建了HCV全基因組克?。簩CV全長PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆獲得了6個HCV全基因組克隆(命名為CQFL1～6)，并經(jīng)質(zhì)粒直接電泳分析及內(nèi)側(cè)引物對(ISP-1、IAP-1)

14、擴(kuò)增HCV全長驗(yàn)證，提示HCV全長基因組克隆構(gòu)建成功。
　　3．序列分析得知所克隆HCV基因組為HCV1b型，與新加坡1b株(accession no. AF356827)親緣性最近。通過NS5B區(qū)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)：相對于其他HCV1b株而言，有4個位點(diǎn)氨基酸為CQFL1～6所特有，分別為250K、424V、435V、564V，其中后3個位點(diǎn)的氨基酸與JFH-1相應(yīng)位點(diǎn)氨基酸一致。推測CQFL1～6 NS5B的空間結(jié)構(gòu)可能較其他