番茄褪綠病毒的分子鑒定、全基因組序列分析及檢測技術(shù)的建立.pdf

1、番茄是最主要的蔬菜之一，但病毒病常導(dǎo)致番茄產(chǎn)量減少和品質(zhì)降低，嚴(yán)重制約著番茄種植業(yè)的發(fā)展。番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）是近年在我國新發(fā)現(xiàn)的病毒，在北方設(shè)施產(chǎn)區(qū)正在嚴(yán)重威脅番茄的生產(chǎn)。
　　本研究以ToCV為研究對象，以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，測定了該病毒山東壽光分離物的全基因組序列并建立了常規(guī)PCR和RT-LAMP檢測技術(shù)，利用優(yōu)化的檢測技術(shù)針對山東省番茄主產(chǎn)區(qū)的ToCV發(fā)病情況進(jìn)行了檢測和

2、病原分子鑒定。本研究的目的是建立高效ToCV的檢測技術(shù)，通過田間檢測，厘清ToCV在山東設(shè)施蔬菜產(chǎn)區(qū)的發(fā)生危害情況以及與其他病毒的復(fù)合侵染情況，同時(shí)，通過對ToCV山東壽光分離物全基因組序列的測定和分析，并結(jié)合對來源不同的ToCV分離物的分子鑒定，針對ToCV山東分離物進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。
　　主要結(jié)論如下:
　　1.對山東省主要番茄產(chǎn)區(qū)（濰坊、泰安、臨沂、日照、聊城）共采集401份番茄樣品進(jìn)行檢測，篩選出355份感染ToC

3、V樣品。獲得的分離物序列（GenBank登錄號KC812620/KC812625、 KC812623/KC812627、 KC812622/KC812626KC812619/KC812624、KC812621)均用于一致率分析與系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果分析表明:本研究的分離物都聚類在了同一個(gè)組上。
　　2.對上述感染ToCV樣品進(jìn)行番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV)的檢測，共檢出56

4、份樣品復(fù)合感染TYLCV。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，檢測到的TYICV分離物（GenBank登錄號KJ546418）歸屬TYLCV以色列株系，該結(jié)果明確了山東設(shè)施番茄產(chǎn)區(qū)ToCV與TYLCV復(fù)合侵染情況的存在。
　　3.建立了ToCV的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）檢測技術(shù)，并對該技術(shù)的反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確認(rèn)了最優(yōu)化體系:10×Thermopol buffer2.5μL，10mM外引物(F3和B3)0.5μL，10mM內(nèi)引物（FIP

5、和BIP）2.0μL，10 mM dNTP2.0μL，25 mM MgCl24.0μL,200 U/μL M-MLV0.5μL,800 U/mL Bst DNA polymerase1.0μL和模板RNA1.0μL在60℃C下反應(yīng)40 min。
　　4.通過融合PCR的方法測定了ToCV山東壽光分離物全基因組，序列分析表明ToCV山東壽光分離物（GenBank登錄號KC709509、KC709510）的核苷酸序列與GenBank上