表達(dá)GFP的重組腸道病毒71型在恒河猴嬰猴模型中的感染機(jī)制研究.pdf

1、腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)是嬰幼兒手足口病(hand，foot,and mouthdisease，HFMD)的主要病原體之一。近期由EV71感染引起的手足口病在亞太地區(qū)的大規(guī)模爆發(fā)，已經(jīng)成為一個為社會所關(guān)注的，嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。EV71感染嬰幼兒所引起的病癥一般較為溫和，但在少數(shù)情況下，EV71的感染可能導(dǎo)致病人出現(xiàn)重癥甚至死亡，而這些重癥病例通常表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的臨床特征，包括無菌性腦膜炎、急性遲緩性麻

2、痹、腦干腦炎，并且常伴有相關(guān)的系統(tǒng)性癥狀，如嚴(yán)重的肺水腫和休克。由于EV71感染所導(dǎo)致的重癥病例的原因迄今尚不清楚，因此針對感染性疾病的臨床治療和預(yù)防工作仍有許多盲點，而基于這一現(xiàn)狀的相關(guān)感染病理機(jī)制的進(jìn)一步研究，正是本次實驗研究的主要目的所在。
　　研究初期以EV71的FY-23株為模板，擴(kuò)增得到基因組全長cDNA并將其連接入pSP64載體中，使用體外轉(zhuǎn)錄體系得到EV71基因組的全長轉(zhuǎn)錄本，并將轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞從而得到EV

3、71拯救病毒株。經(jīng)鑒定其遺傳特性、生長特性、致病性和免疫原性均與母株病毒性狀基本相似。在此基礎(chǔ)上，使用搭橋PCR技術(shù)將綠色熒光蛋白基因插入EV71的VP4基因中，獲得能夠穩(wěn)定傳代并表達(dá)綠色熒光蛋白的重組EV71病毒。利用該重組病毒在感染細(xì)胞的過程中能夠表達(dá)其熒光標(biāo)記的特性，我們可以在感染的恒河猴嬰猴動物模型上直觀地觀察病毒感染部位和途徑。
　　我們在前期的研究工作中，已建立了恒河猴嬰猴EV71感染的動物模型，該模型已被成功應(yīng)用于E

4、V71致病機(jī)理及藥物開發(fā)研究。在本次實驗中，試驗分別通過呼吸道攻毒（鼻腔噴霧）和腸道攻毒（飲水）兩種途徑，使用104.5CCID50/只的感染劑量對恒河猴嬰猴進(jìn)行攻毒，實驗組使用的毒株為綠色熒光蛋白重組病毒，對照組毒株為具有野生表型的FY-23株。首先，我們發(fā)現(xiàn)兩種攻毒方式均能引起嬰猴體溫升高和病毒血癥，但呼吸道途徑攻毒方式所產(chǎn)生的病理特征更為明顯。在呼吸道攻毒的嬰猴中不僅表現(xiàn)出手足口部的皰疹，而且伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)和肺水腫，這

5、一特征與人類重癥病例癥狀極為相似。其次，從呼吸道途徑感染嬰猴的病理切片上觀察到明顯的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸道系統(tǒng)器官病理改變。另外通過兩種途徑感染的嬰猴，其呼吸系統(tǒng)的病毒載量都有增加，而通過呼吸道途徑感染的嬰猴病毒載量升高較明顯，但二者在腸道中的病毒載量均無明顯增加。綜上所述，呼吸道途徑感染嬰猴所引起的病癥更為典型，因此，接下來重點研究呼吸道途徑感染恒河猴嬰猴的相關(guān)病理機(jī)制。
　　利用冰凍切片和免疫熒光技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)在感染初期EV71

6、主要在呼吸道上皮細(xì)胞和淋巴結(jié)中增殖，并且在稍晚時中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦干部位觀察到病毒發(fā)出的綠色熒光。進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光共定位分析，結(jié)果表明EV71能夠感染樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)，在不同亞群的DC中EV71偏好于感染CD141+DC。實驗表明在病毒感染早期，CD141+DC被募集至感染部位并被病毒侵染。隨后，DC可能搭載著病毒從最初的感染部位遷移至淋巴結(jié)，進(jìn)一步隨循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等靶器官。EV71感